如何选择紫外/可见分光光度计

[2010/5/9]

一、分光光度计的工作原理
  分光光度法是根据被测物质分子对紫外、可见波段范围单色辐射的吸收或反射强度来进行物质的定性、定量或结构分析的一种方法。
  物质呈现特征的颜色，这是由于它们对可见光中某些特定波长的光线选择性吸收的缘故。实际上，一切物质都会对可见光和不可见光中的某些波长的光线进行吸收。但是，一切光线并不都是以相同的程度被物质吸收的。物质对不同波长的光线表现不同的吸收能力，叫做选择性吸收。各种物质对光线的选择性吸收这一性质，反映了它们分子内部结构的差异，即各种物质的内部结构决定了它们对不同光线的选择吸收。
  朗伯-比耳定律（Lambert-Beer）是几乎所有的光学分析仪器的基本工作原理，它由朗伯定律和比耳定律合并而成。
          朗伯定律表明：如果溶液的浓度一定，则光对物质的吸收程度与它通过的溶液厚度成正比。
          比耳定律表明：如果吸光物质溶于不吸光的溶剂，则吸光度和吸光物质的浓度成正比。
两者合成后的数学表达式如下：
      T=I/I。（1）
      A=KCL=‐㏒ I/Io （2）
其中
    T 透过率
    A 吸光度
    C 溶液浓度
    K 溶液的吸光系数
    L 液层在光路中的长度
    I 光透过被测试样后照射到光电转换器上的强度
    Io 光透过参比测试样后照射到光电转换器上的强度

二、产品类型结构：

光度计
      可见分光光度计
           紫外/可见分光光度计
                 扫描型紫外/可见分光光度计
                        双光束紫外/可见分光光度计

三、仪器技术参数解释
     波长范围：仪器可选波长的测量范围。不同的物质吸收所对应的吸收波长不一样。
    氘灯：紫外光源                    185-400nm
    钨灯：可见和近红外光源      250---2000nm
   光谱带宽：目前国际上对光谱带宽的测试方式一般用“谱线轮廓法”，主要是选用某些光源的特征谱线，对它进行光谱扫描，绘出该谱线的轮廓，再测出该谱线的半峰高的宽度即为光谱带宽（又称自然光谱带宽）。仪器使用的光谱带宽通常要比自然光谱带宽小10倍以上。
    波  长  准  确  度：也叫波长精度，是波长的实际测定值与理论值的差值。
   波  长  重  复  性：多次测量（一般是3次）最大值与最小值之间的差值。
   光  度  准  确  度：光度测量值与光度理论值之差。
   影响光度准确度的主要因素：
      ①杂散光      ②光度噪声      ③基线平直度
      ④光谱带宽  ⑤试样来源      ⑥试样制备
      ⑦比色皿
   光  度  重  复  性：多次测量（一般是3次）最大值与最小值之间的差值。
   影响光度重复性的主要因素：
      ①光源系统（氘灯、钨灯）
      ②光电转换器系统
      ③电源系统
      ④环境
  杂    散    光：不同于测试所需要的波长的光叫做杂散光。

影响杂散光的主要因素：
  ①灰尘沾污光学元件   ②隔板边缘的反射
  ③光学系统屏蔽不好   ④狭缝的缺陷
  ⑤光束孔径不匹配       ⑥光学系统的像差
  ⑦单色器内壁黑化处理不当   等等

      杂散光对分析测试结果的误差影响是随着吸光度值增大而增大的，会使结果偏离比耳定律。

      ·杂散光被试样吸收时，偏离是正值。
      ·杂散光不被试样吸收时，偏离是负值。

稳    定    性：稳定性包括基线漂移和光度重复性。

基线漂移是指冷态开机预热2小时后调零，试剂和参比比色皿都为空气，在固定波长（500nm）下连续测定吸光度1小时，最大值和最小值之差。
光度噪声（噪声）：

       噪声是指冷态开机预热0.5小时后调零，试剂和参比比色皿都为空气，在500nm下连续测定吸光度1小时，偏离零点的最大值。
      基线平直度：
      基线平直度是指冷态开机预热0.5小时后调零，从长波长向短波长对仪器进行全波长慢速扫描吸光度，偏离零点的最大值。
吸光度和透过率的关系：透过率和吸光度是一一对应的关系，关系式如下：
A=2 – lgT%
其中    A为吸光度
           T为透过率
        若T=100%，A = 2 - lg100 = 2 - 2 = 0
        若T=10%  ，A = 2 - lg10   = 2 - 1 = 1
光度分析：固定波长下测定样品的吸光度和透过率。

定量分析：通过对已知浓度的样品进行吸光度的测定，制作标准曲线，得出曲线的线性方程C=KA+b。再测定未知样品的吸光度，通过线性方程求出样品的浓度。
动力学测试：固定波长下，测定样品在一段时间内吸光度或透过率的变化图谱，可计算样品的反应率△A/t。

    需设定的参数：
         扫描时间，最多9小时；
         采样间隔，最小为0.5秒；
         延时时间
         扫描波长
全波长扫描：在仪器波长范围内，设定任意波长区间，对未知试样进行吸光度、透过率的图谱扫描。

     需设定的参数：
         扫描波长范围
         扫描间隔，0.1、0.2、0.5、1、2、5nm；
         扫描速度，建议为低速；
         T/A模式
图谱处理
     图谱放大、缩小、峰谷检测、平滑等处理；
     图谱存储和调用；
     使用PC版软件可进行1-4阶求导、四则运算、叠加等分析。
多波长测试：对某一待测物质在多个波长点进行吸光度、透过率测试。

    单机版可测试10个波长点；
      PC版可测试32个波长点。
DNA/蛋白质测试
    测试波长缺省值为260、280、320nm，可修改。
    可计算DNA、Protein的浓度和Ratio。

单光束分光光度计特点：结构简单、价格便宜

杂散光、光度噪声、光谱带宽等主要技术指标差，不适合用于技术要求较高的行业，如制药、科研、质量检验行业。
准双光束分光光度计特点：结构较简单、价格较便宜。
有一束作为参考光束，能部分抵消光源振动、电子学噪声，以提高仪器的稳定性。
只有一个比色皿，不能抵消杂散光。
双光束双转换器分光光度计特点：能部分抵消光源波动、杂散光、电噪声的影响，光度准确好；
结构较复杂、价格昂贵；
因一束光分为两束，每束光的能量低，信噪比不如单光束光度计好；
两个转换器不能完全匹配，故扫描测量误差大，不建议用来做光谱扫描。
双光束单检测器分光光度计特点：能部分抵消光源波动、杂散光、电噪声的影响，光度准确好、技术指标很先进；
结构较复杂、价格昂贵；
因一束光分为两束，每束光的能量低，信噪比不如单光束光度计好。但两束光路对噪声可相互抵消，灵敏度仍然很好。

四、分光光度计的评价和挑选：
    适用性
    可靠性
    智能型
    经济性
    美学性
    工艺性
适    用    性：适用性—满足使用要求的程度，主要由技术指标所决定。
波长准确度：
对于一般的定量分析，波长准确度不是很重要；
对不同试样进行比对测试时，波长准确度就相当重要。

杂散光：
      在分析的试样较多，浓度较大时很重要。

杂散光一定时，分析测试的数据会随着浓度的增大，偏离比耳定律的程度就越大，故对待测试样的浓度上限有严格要求；
分析品种较多的食品、农业等领域，必须挑选杂散光小的仪器。

光度噪声：
      分析测试误差的主要来源，且限制被分析试样浓度的下限。

光度噪声一定时，浓度越低，分析测试的数据的误差就越大，故对待测试样的浓度下限限制较大；
生化、海洋研究等领域，必须挑选光度噪声小的仪器。
光谱带宽

一般常规的在可见光区的分析工作，带宽一般选择4nm；
用于制药行业的药检，光谱带宽在2nm或以下；
科研工作建议选择可调带宽的仪器。
可    靠    性：从狭义上讲，可靠性就是仪器的故障率。

从广义上讲，可靠性应从分光光度计的制造和使用两个方面衡量，包括光度准确度、稳定性、故障率及售后服务等内容。

影响可靠性的因素：首先要查看自己对仪器条件（如光谱带宽、扫描速度、采样间隔、标尺设定等）的选择是否恰当，是否对仪器进行了调零、基线校正、暗电流校正等；
要严格检查影响仪器光度准确度的主要指标：杂散光、光学元件（尤其是旧机器）、光度噪声、基线平直度；
检查比色皿是否被污染；
查看周围有无干扰源，主要是电和磁的干扰；
检查试样制备的过程；
检查试样是否过期等等。

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