九节茶高效液相色谱指纹图谱分离条件的优化

[2012/1/12]

　　【摘要】目的优化九节茶HPLC指纹图谱分离条件。方法使用色谱柱KromasilC18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-0.2%磷酸溶液，柱温为25℃，流速为0.7ml/min，检测波长为340nm，考察九节茶的最佳梯度洗脱条件。结果经优化的分离条件为：0～35min，甲醇由20%线性增至40%;35～65min甲醇由40%增至60%，65～75min甲醇由60%减至20%，75～78min甲醇保持20%，可使主要成分达到较好的分离。结论通过对九节茶HPLC指纹图谱分离条件的优化，更有利于控制九节茶药材的质量。

　　【关键词】九节茶高效液相色谱指纹图谱

　　九节茶系金粟兰科植物草珊瑚Sarcandraglabra(Thunb.)Nakai的干燥全草，又名肿节风、接骨金粟兰、草珊瑚、接骨木，为多年生常绿草本或亚灌木。九节茶味苦辛、性平、有小毒，有祛风通络、活血散淤、止血止痛、接骨续筋之功用[1]，临床应用广泛，特别是对呼吸系统、消化系统的炎症性疾患具有较高疗效，还用于骨伤科疾病及各种癌症。

　　《中国药典》2005年版Ⅰ部对九节茶药材的质量控制是采用HPLC测定其中异嗪皮啶的含量[2]，但是单一指标性成分的含量测定往往难以反映中药整体质量，不能较全面反映中药品质。有文献报道过九节茶药材的指纹图谱的研究[3，4]，在实际应用中发现上述指纹图谱的获取方法重复性差。本文拟对九节茶的液相色谱指纹图谱分离条件进行优化，从而为中药九节茶质量控制提供更好的方法。

　　1材料与仪器

　　1.1材料九节茶药材经广州中医药大学新药开发与研究中心高英主任中药师鉴定为金粟兰科植物草珊瑚Sarcandraglabra(Thunb.)Nakai的全草;甲醇为色谱纯;水为液相用水;其他试剂均为分析纯。

　　1.2仪器DionexSummit高效液相色谱仪(P680HPLCPump,ASI-100AutomatedSampledInjector,PDA-100PhtodiodeArrayDetecter,UVD170U,STH585ColumnOven)，Chromeleon数据处理系统,KromasilC18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm);超声波清洗器(SB-5200，中国船舶工业总公司第七研究院第七二六研究所);R-114型旋转蒸发仪(BuCHI，瑞士)。

　　2方法与结果

　　2.1供试品溶液的制备取药材粗粉1.0g(过20目筛)，加水回流提取两次，每次加水20ml，提取1h，滤过，合并滤液，蒸干，残渣转移至25ml量瓶中，加80%甲醇约20ml，超声30min，放至室温，用甲醇定容，离心，小心吸取上清液，用微孔滤膜过滤后备用。

　　2.2梯度洗脱条件的优化

　　2.2.1优化条件Ⅰ经过实验，得到以下的初始条件：

　　图1a条件：0～50min,甲醇由5%线性增至70%;50～60min甲醇由70%增至90%，进样量为10μl，柱温为25℃，流速为0.7ml/min。其色谱图(见图1a)可以看出，主要成分的色谱峰集中于10～30min内被洗脱，30～60min内未出现色谱峰，表明所有成分均已被洗脱。

　　图1b条件：0～35min,甲醇由5%线性增至25%;35～60min甲醇由25%增至45%，进样量为10μl，柱温为25℃，流速为0.7ml/min。色谱图(见图1b)可以看出，主要成分的色谱峰集中于20～50min内被洗脱，但0～20min内几乎没有色谱峰出现，因此需要继续优化。

　　2.2.2优化条件Ⅱ

　　图2a条件：0～40min,甲醇由10%线性增至30%;40～60min甲醇由30%增至45%，进样量为10μl，柱温为25℃，流速为0.7ml/min。其色谱图(见图2a)可以看出，主要成分的色谱峰集中于5～50min内被洗脱，但峰与峰的重叠较大。

　　图2b条件：0～40min,甲醇由15%线性增至35%;40～60min甲醇由35%增至50%，60～70min甲醇由50%减至15%，70～72min甲醇保持15%，进样量为10μl，柱温为25℃，流速为0.7ml/min。色谱图(见图2b)可以看出，色谱峰的分布有所改善，但峰与峰的分离状况不理想。

　　图1优化条件Ⅰ的HPLC图(略)

　　图2优化条件Ⅱ的HPLC图(略)

　　2.2.3优化条件Ⅲ

　　图3a条件：0～35min,甲醇由17.5%线性增至40%;35～60min甲醇由40%增至60%，60～70min甲醇由60%减至17.5%，70～72min甲醇保持17.5%，进样量为10μl，柱温为25℃，流速为0.7ml/min。其色谱图(见图3a)可以看出，色谱峰之间基本达到分离，且均匀分布在0～60min内，但部分峰有拖尾的现象。

　　图3b条件：0～35min,甲醇由20%线性增至40%;35～65min甲醇由40%增至60%，65～75min甲醇由60%减至20%，75～78min甲醇保持20%，进样量为10μl，柱温为25℃，流速为0.7ml/min。色谱图(见图3b)可以看出，无论是色谱峰的分离度、分布均匀性及峰形均与指纹图谱技术要求相符合。

　　图3优化条件Ⅲ的HPLC图(略)

　　2.3方法学考察为考察分析方法的可靠性，对其稳定性、仪器精密度、实验方法重现性进行考察。

　　2.3.1精密度实验取供试品溶液连续进样5次，记录指纹图谱。以保留时间为49.5min的峰为参照物峰，计算共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值分别在0.48%～0.92%和1.15%～1.97%之间，符合指纹图谱要求。

　　2.3.2重现性实验精密称取药材5份，照供试品溶液制备方法制备5份样品溶液，分别进样并记录指纹图谱。以保留时间为49.5min的峰为参照物峰，共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值分别在0.45%～1.03%和1.41%～2.06%之间，基本符合指纹图谱要求。

　　2.3.3稳定性实验取供试品溶液分别于0，2，6，12，24h进样分析，记录色图谱，以保留时间为49.5min的峰为参照物峰，计算共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值分别为0.36%～0.96%和1.20%～2.33%之间，表明样品溶液在24h内稳定。

　　2.3.4不同产地药材的HPLC图谱见图4。

　　图4不同产地药材的指纹图谱(略)

　　3讨论

　　3.1流动相的选择九节茶中的化学成分有倍半萜及其苷类、黄酮及其苷类、有机酸类、香豆素类，这些成分多具有一定的极性和酸性[5]。本实验比较了乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸、乙腈-0.1%醋酸、乙腈-1%醋酸、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.2%磷酸、甲醇-0.1%醋酸、甲醇-1%醋酸等流动相的分离效果。结果同一条件下甲醇较乙腈对九节茶提取物的分离效果较佳，0.2%磷酸溶液较其他酸溶液对九节茶提取物的分离效果较佳，因此选择甲醇和0.2%磷酸作为流动相单元。

　　3.2柱温的选择在实验过程中，发现柱温对分离效果影响较大，同一条件下考察了20，25，30，35℃柱温对九节茶提取物的分离效果的影响，结果25℃较佳。

　　3.3流速的选择在同一条件下考察了0.6，0.7，0.8，1.0ml/min流速对九节茶提取物的分离效果的影响，结果0.7ml/min流速的分离效果较佳。

　　3.4检测波长的选择选择340nm作为检测波长[3]。

　　在进行等度洗脱时，如果溶剂的洗脱能力过强，则不能把主要成分的色谱峰分开;溶剂的洗脱能力弱时，虽然能够分开，但保留时间太长、峰形不理想。为了得到分离度好、保留时间合适、峰形理想的色谱峰，只有选用梯度洗脱。

　　液相色谱条件中的柱温、流速对色谱峰的影响不大，因而应主要调整流动相的组成、溶剂的比例及梯度陡度，从而使各色谱峰之间达到较好的分离。考察流动相的组成时，在反相色谱中,甲醇的洗脱强度比乙腈要小，因而甲醇酸水系统色谱峰的峰形和分离度都要好于乙腈酸水系统。同时磷酸比醋酸的酸性强，对药材中的酸性成分电离的抑制性强，选用磷酸可以确保色谱峰不拖尾。

　　经实验，优化条件Ⅲ得出的九节茶液相色谱图的分离度、分布均匀性及峰形好，可用来评价不同产地、品种的九节茶的指纹图谱的质量差异。

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