结晶紫法检测TNF的生物活性

[2012/5/4]

  TNF包括TNFα与TNFß两型,它们具有极其相似的生物学活性,在体内外可对一些肿瘤细胞或细胞系起杀伤作用,而对正常细胞则无细胞毒效应。根据这一特点,可利用TNF对敏感靶细胞的细胞毒效应,在体外检测TNF的活性水平,既可检测分泌型TNF(sTNF),也可检测膜结合型TNF(mTNF)。最常用的方法是体外检测TNF对小鼠成纤维瘤细胞(L929细胞)的细胞毒效应。

  【基本原理】

  TNF对L929细胞有细胞毒作用,如同时加用转录抑制剂放线菌素D,则可提高L929细胞对TNF的敏感性10~100倍。利用染料结晶紫或MTT可使活细胞染色,再用脱色液将染料脱出,测定其OD值,即可反应细胞的存活状态或TNF对L929细胞的杀伤率,通过计算细胞死亡率,并与sTNF标准品对照,即可检测待测样品sTNF活性单位。

  【材料和试剂】

  (1)L929细胞株(存活率应>95%)

  (2)TNF标准品:作倍比稀释(100U/ml~0.1U/ml)。

  (3)待测样品:作倍比稀释至少6个不同稀释度。

  (4)0.25%胰蛋白酶

  (5)RPMI-1640培养液及PBS

  (6)0.25%结晶紫(溶于20%甲醇中),或者5mg/mlMTT(溶于PBS中)

  (7)放线菌素D(分存液浓度为100ug/ml)

  (8)柠檬酸钠缓冲液(0.9%柠檬酸钠,0.02mol/L盐酸,47.5%乙醇,为脱色液);酸化异丙醇(0.04mol/LHCL异丙醇)

  (9)96孔细胞培养板,刻度吸管,毛细吸管,加样器(头),刻度离心管,离心机,细胞计数板,倒置显微镜,超净工作台,CO2培养箱。

  (10)酶标测定仪,570nm滤光片,630nm滤光片。

  【操作步骤】

  (1)取对数生长期的L929细胞,用0.25%胰蛋白酶消化2-3min,然后洗涤细胞2次,以去除消化液及原生长培养液;

  (2)用RPMI-1640培养液调L929细胞浓度为2×105/ml;

  (3)将上述细胞悬液加至96孔培养板,100ul/孔;

  (4)置37℃,5%CO2培养箱中培养24h;

  (5)吸去细胞培养上清液后,各孔分别加入倍比稀释的标准品和待测样品,100ul/孔,各设双复孔,并设培养液阴性对照及空白对照(即L929细胞、标准品及待测样品均不加入,仅加培养液);

  (6)同时向各孔均加入10ul放线菌素D(0.5~1μg/孔);

  (7)置37℃,5%CO2培养箱中培养12-14h;

  (8)甩弃上清,并用RPMI-1640培养液洗细胞1次;

  (9)每孔均加入0.25%结晶紫,100μl/孔,室温下染色10min;

  (10)甩弃上清,再用PBS洗板3次;

  (11)室温下凉干,加入柠檬酸钠缓冲液脱色,100μl/孔;

  (12)充分混匀后,用酶标仪以检测波长570nm,参考波长630nm测各孔OD值。