组织匀浆的制备方法

[2012/6/4]

　　1、取组织块(0.2g~1g)最少可到2～5mg，在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，放入5或10ml的小烧杯内

　　2、用移液管量取预冷的匀浆介质(ph7.4,0.01mol/L Tris-HCL, 0.0001MOL/LEDTA-2Na,0.01mol/L蔗糖0.8%的氯化钠溶液)或者用0.86%冷生理盐水，匀浆介质或生理盐水的体积总量应该是组织块重量的9倍，用移液管或移液器取总量的2/3的匀浆介质或生理盐水于烧杯中，用眼科小剪尽快剪碎组织块(天然时操作要在冰水浴中进行，将盛有组织的小烧杯放入冰水中)。

　　3、匀浆的方式有多种：手工匀浆、机器匀浆、超声匀浆、反复冻融。

　　手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次(6～8分钟)，充分研碎，使组织匀浆化。

　　机器匀浆：用组织研磨机(OMNIBead Ruptor 24 多样品研磨珠均质仪) 6m/s研磨制成10%组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备(Omni Prep 多样品均质仪 )匀浆时间20秒/次，间隙10秒，连续3-5次。

　　超声粉碎：用超声波细胞破碎仪(OMNI Sonic Ruptor400W)进行破碎，可用以振幅12.7mm超声处理30秒使细胞破碎.

　　反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右(即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右)，但有部分酶活力会受影响。

　　取少量组织匀浆做涂片(直接涂片、染色均可)，显微镜下观察细胞是否磨破，若没有破则可以延长匀浆时间或增加冻融次数。

　　4、将制备好的10%匀浆用普通离心机或低温低速离心机3000r/min左右离心10～15分钟，若检测ATP酶，则只需要1000转/分，离心5分钟，将离心好的匀浆留下上清弃下面沉淀。

　　根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种测定。

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