高效液相色谱法的优点和常见问题

[2012/11/26]

　　高效液相色谱(HighPe-rformanceLiauidChromatography，HPLC)的主要优点是：⑴分辩率高于其它色谱法⑵速度快，十几分钟到几十分钟可完成;⑶重复性高;⑷高效相色谱柱可反复使用;(5)自动化操作，分析精确度高。根据分离过程中溶质分子与固定相相互作用的差别，高效液相色谱可分为四个基本类型，即液-固色谱、液-液色谱、离子交换色谱和体积排阻色谱。高效液相色谱在生物领域中广泛用于下列产物的分离和鉴定：⑴氨基酸及其衍生物;⑵有机酸;⑶甾体化合物;⑷生物硷;⑸抗菌素;⑹糖类;⑺卟啉;⑻核酸及其降解产物;⑼蛋白质、酶和多肽;⑽脂类等。高效液相色谱的常见问题有：

　　1、涡流扩散(Eddydiffusion)

　　流动相碰到较大的固体颗粒，就像流水碰到石头一样产生涡流。如果柱装填得不均匀，有的部分松散或有细沟，则流动相的速度就快;有的部位结块或装直紧密则流就慢，多条流路有快有慢，就使区带变宽。因此，固相载体的颗粒要小而均匀，装柱要松紧均一，这样涡流扩散小，柱效率高。

　　2、分子扩散(Moleculardiffusion)

　　分子扩散就是物质分子由浓度高的区域向浓度低的区域运动，也称纵向分子扩散。要减少分子扩散就要采用小而均匀的固相颗粒装柱。同时在操作时，如果流速太慢，被分离物质停留时间长，则扩散严重。

　　3、质量转移(Masstransfer)

　　被分离物质要在流动相与固定相中平衡，这样才能形成较窄的区带。在液相色谱中，溶质分子要在两个液相之间进行分配，或在固相上被吸附和解吸附均需要一定的时间。当流速快时，转移速度慢，来不及达到平衡动相就向前移，这各物质的非平衡移动，使区带变宽。

　　4、动相流速

　　当流速太低时，分子扩散严重，特别是在气相色谱中尤为突出。如将理论塔板高度对流速作图，理论塔板高度随流速增加而急速下降，当达到最低值时，流速再加大则质量转移起主要作用，理论塔板高度又加大。在高效液相色谱中，流速稍快影响不大，但在凝胶过滤色谱中，因为物质要渗透到凝胶内部，所以质量转移影响大，流速咖大会降低柱效率。

　　5、固定相颗粒大小

　　定相颗粒越小柱效率越高，对流动相流动的阻力越大，需要加大压力才能使它流动。

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