高效液相色谱法测定猪血清中的依维菌素

[2012/12/12]

　　猪血又称液体肉、血豆腐和血花等，味甘、苦，性温，有解毒清肠、补血美容的功效。猪血富含维生素B2、维生素C、蛋白质、铁、磷、钙、尼克酸等营养成分。

　　建立猪血清中依维菌素(ivermectin)的高效液相色谱测定方法。方法：以0。05 偏磷酸-甲醇(7：3)沉淀猪血清蛋白后用乙酸乙酯提取依维菌素，离心后取上清液用旋转真空蒸发器挥干溶剂，用甲醇溶解残渣后进样分析。色谱柱为反相柱(5μm，250mm×4.6mm)，流动相为甲醇-水(90：10)，流速1ml/min，紫外检测波长为245nm 结果方法检出下限为0.010mg/L，线性范围为0.010～20mg/L，相对标准差为0.78%～3.82%，加标回收率为94.0%～100.O%。结论本法操作简便，结果准确可靠，适用于猪血清中微量依维菌素的测定。

　　「关键词」高效液相色谱法;猪血清;依维菌素

　　依维菌素是一种新型高效广谱抗寄生虫药，对线虫、昆虫和螨虫等均有驱杀作用，可用于防治家畜和宠物的寄生虫病。其在体内有一定的蓄积性，人食用了这些家畜肉制品后，依维菌素会对人体健康产生危害。因此，需测定动物血清中依维菌素的含量。对于基体简单的样品如药片和注射液中依维菌素含量的测定可用紫外分光光度法和高效液相色谱法。血清样品基体复杂，干扰成分多，其测定相对困难，国外已有荧光衍生-HPLC法的报道，该法灵敏度高，但衍生化步骤繁琐，分析成本较高。本研究利用0.05%偏磷酸-甲醇(7：3，V/V)沉淀血清蛋白、乙酸乙酯提取其中微量依维菌素，高效液相色谱法测定含量，取得了较为满意的结果。

　　1 材料与方法

　　1。1 主要试剂及仪器

　　甲醇(色谱纯);乙酸乙酯(分析纯);偏磷酸(分析纯);依维菌素标准储备液：准确称取0.0500g依维菌素(中国兽药监察所提供，批号KY31297)于25ml容量瓶中，加甲醇溶解定容，此液质量浓度为2.00mg/ml。临用前，用甲醇稀释成应用液。本实验用水均为纯水。

　　液相色谱仪;反相色谱柱：5μm，250mm×4.6mm;色谱保护柱;紫外可见分光光度计;离心机;旋转真空蒸发器。

　　1。2 实验方法

　　1。2。1 色谱条件流动相：甲醇-水(90：1O)，流速1ml/min，柱温25℃，反相C18色谱柱(5μm，250mm×4.6mm)分离，紫外检测波长为245nm。

　　1。2。2 标准曲线绘制取依维菌素标准应用液用甲醇稀释成0.10mg/L，0.25mg/L，0.50mg/L，1.O0mg/L，2.50mg/L，在仪器基线达到平直后，分别进样20μl。依维菌素保留时间为17.0min左右。以进样量(X，ng)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，计算线性回归方程。本标准曲线回归方程为Y=1.75X一0.12，r=0.9994。

　　1。2。3 样品处理及测定取猪血清1.00ml置于10ml离心管中，加0.05%偏磷酸-甲醇(7：3，V/V)1.00ml，漩涡混匀，加4.00ml乙酸乙酯振摇200次提取，4000r/min离心5min。吸取乙酸乙酯层3.O0 ml于10ml离心管中，于40℃水浴下用旋转真空蒸发器挥干。加0.20ml甲醇旋涡振荡1min并超声1min溶解，4000 r/min离心5min后取上清液进样100μl。

　　2 结果与讨论

　　2。1 色谱条件的优化

　　2。1。1 检测波长的选择在200nm～400nm范围内，用UV-260紫外可见分光光度计对依维菌素进行紫外扫描，其在245nm及238nm均有峰值吸收，本法选择245nm为检测波长。

　　2。1。2 流动相中甲醇比例的选择改变流动相中甲醇与水的比例，观察保留时间及峰形的变化。实验结果表明，流动相中甲醇含量对依维菌素保留时间影响较大。甲醇含量从100%变化为90%时，保留时间从4.9min变化为17.0 min。17.0min时可将依维菌素与血清中杂质基本分离。所以，本法选用甲醇-水(90：10)为流动相。

　　2。1。3 柱温的选择柱温影响待测物质与流动相、固定相之间的分配、吸附，也影响流动相的粘度，进

　　而影响保留时间和峰形。比较了柱温为20℃、25℃、30℃时的依维菌素的出峰时间及峰形，结果无明显差别。本法选用柱温为25℃。

　　2。2 样品提取条件的优化

　　2。2。1 提取溶剂的选择从依维菌素的分子式可以看出它是相对分子质量大、极性小的化合物，应选用极性小的有机溶剂进行提取。实验结果表明，在相同的条件下，乙酸乙酯的提取效率为94.3%;二氯甲烷的提取效率为26.7%。正己烷、乙醚的提取效率为74.0%。故选用乙酸乙酯作为提取剂。2.00ml乙酸乙酯的提取效率小于70%，4.00ml提取效率为94.3%，本法选用4.00ml乙酸乙酯进行提取。

　　2。2。2 沉淀剂及其用量的选择根据文献，本法选用0.05%偏磷酸-甲醇(7：3，V/V)为血清蛋白沉淀剂，实验结果表明，该沉淀剂沉淀效果好，回收率高。本法选用该沉淀剂用量为1.00ml。

　　2。3 方法考察及性能实验

　　2。3。1 检出限和线性范围以两倍信噪比计算本法样品的检出下限为0.010mg/L。本法线性范围至少为0.010～20mg/L。

　　2。3。2 方法精密度将三种质量浓度(0.25mg/L，1.O0mg/L，2.50mg/L)标准溶液于同一天内连续进样测定6次，得日内相对标准差。

　　2。3。3 加标回收实验可见，本法回收率范围为94.0%～100.0%，平均为97.3%。

　　2。4 方法应用

　　3 讨论

　　常用于评价收缩和舒张功能的指标如射血分数、二尖瓣前向血流E/A及等容舒张时间，都不同程度地受到心率、心脏前后负荷及心脏几何形态的影响。当心室收缩不一致时，射血分数反映心功能有局限性。心脏功能不全时心脏收缩和舒张功能异常常合并存在，因此综合评价心脏的整体功能更加合理。心肌运动指数，即Tei指数，是一个重要的综合收缩功能和舒张功能的多普勒参数，不受左室几何形态及心率的影响。国外系列报道证明心肌运动指数在评价充血性心力衰竭、扩张型心肌病及先心病等患者的心室功能方面有重要的临床价值。

　　本研究中无冠脉狭窄组的心肌运动指数在0.47士0.05，冠脉狭窄组的心肌运动指数高于没有冠脉狭窄组，与Dagdelen的结果相似。此外可见心肌运动指数有随狭窄冠脉支数增加而增加的趋势，反映左室整体功能随狭窄冠脉范围扩大而降低。狭窄冠脉的范围及心肌缺血范围对预后有重要影响，本研究中4组病例的射血分数均在正常范围内，没有差异，可以看出心肌运动指数能更敏感地反映左室整体功能的改变，提示心脏功能的早期改变，利于临床干预。因此，认为心肌运动指数能有效地反映不同狭窄范围冠脉和缺血区域的左室整体功能变化，能更好地反映心功能，预示预后。由于样本量较小，本研究未能将冠心病患者分为心绞痛组和心肌梗死组，这有待于进一步研究。

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