临床生物化学光谱分析技术的研究

[2013/1/29]

　　利用各种化学物质所具有的发射、吸收或散射光谱谱系的特征，来确定其性质、结构或含量的技术，称为光谱分析技术。根据光谱谱系的特征不同，可把光谱分析技术分为发射光谱分析、吸收光谱分析和散射光谱分析三大类。在临床生物化学检验中，光谱分析是一类十分重要的技术，应用极为广泛。

　　I.光谱分析法(photometry)

　　1.定义：根据物质吸收、发射或散射辐射能而建立起来的一类分析方法。

　　2.光的基本性质：高速传播的电磁辐射;

　　具有波动性(l=c/v)和微粒性(E=hv);短波能量大，长波能量小

　　3.物质对光吸收的基本原理：

　　能量转移----当光辐射通过某种物质时，组成该物质的分子与光子发生“碰撞”，光子的能量就转移至分子、原子上，使它们由基态(低能态)跃迁到激发态(高能态)，这种跃迁称为激发。

　　选择吸收----组成物质的分子仅吸收与其内能变化(基态与激发态能量差)相对应的波长或频率的光，所得到的光谱称为吸收光谱。

　　能量释放----处于较高能态的分子(激发态分子)不稳定，当其返回基态时，以热或发射光谱的形式将能量释放出来。所发射出的相应光谱，称分子发射光谱。

　　4.分类

　　(1)吸收光谱分析法：根据溶液能吸收由光源发出的某些波长的光后所形成的特征光谱来鉴定该物质的性质和含量的方法。

　　(可见、紫外分光光度法(visibleandultravioletspectrophotometry)原子吸收光谱法(atomicabsorptionspectrophotometry)：微量金属元素红外分光光度法)

　　(2)发射光谱分析法：根据物质受到热能或电能等的激发后所发射出的特征光谱来进行定性及定量分析的一种方法。

　　(火焰发射光谱法(flameemissionphotometry)：碱金属/碱土金属元素荧光光谱法(fluorometry)：少量无机物、酶活力、激素等)

　　(3)比浊/散射光谱分析法：测定光线通过溶液混悬颗粒后的光吸收或光散射程度的一类定量方法。

　　比浊法(turbidimetry)：在光源的光路方向上测定透射光强度(透射光&散射光)与入射光强度的比值和胶体溶液中质点浓度间的关系。

　　散射测浊法(nephelometry)：在光路的垂直方向上测量散射光强度和胶体溶液中质点间的关系。

　　5.特点：灵敏度高;测定简便、快速;试样不被破坏等。

　　II.可见、紫外分光光度法

　　1.定义：根据物质分子对于200nm~700nm光区电磁辐射的吸收特性进行分析的方法。

　　可见光：400~700nm,有色物质溶液

　　紫外光：200~400nm,无色物质

　　2.特点：灵敏度高(10-4~10-7g/ml);选择性强;精确度和准确度高;仪器设备简单，操作易掌握

　　3.吸收光谱

　　(1)光谱的产生：化合物分子的价电子跃迁

　　(2)吸收光谱曲线：电子跃迁的吸收波长和吸收强度可用仪器测定，在可见、紫外光区内绘制或扫描得到一条以波长(l)为横坐标,吸光度(A)为纵坐标的吸收曲线。

　　4.光吸收的基本定律(Lamber-Beer’sLaw)

　　(1)定律：单色光通过吸光溶液后，吸光度与浓度或厚度之间呈正比关系。

　　Lamber定律：说明吸收与厚度间的关系

　　Beer定律：说明吸收与浓度间的关系

　　(2)表达式：

　　*a为吸光系数(absorptivity),即吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸光度。

　　b为液层厚度

　　c为溶液浓度(concentration)

　　5.比色法(colorimetry)

　　(1)定义：用可见光作光源，比较溶液的颜色深浅度以测定所含有色物质浓度的方法

　　(2)所用仪器：分光光度计(spectrophotometer)

　　(i)基本原理：溶液中的物质在光的照射激发下，产生了对光吸收的效应，物质对光的吸收是具有选择性的。各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱，故当某单色光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系。

　　(ii)结构组成(以722分光光度计为例)

　　光源：可见光区的光源为钨灯，波长范围是320~1000nm。

　　(紫外光区的光源为氢灯或氘灯，波长是200~320nm)

　　单色器：一种将光源产生的混合光分解为单一波长的光学系统。一般是根据通过棱镜的折射或光栅的衍射而获得的。

　　试样室：由比色皿座架及光门组成。可见光区用光学玻璃比色皿(紫外光区用石英比色皿)

　　光电管暗盒：由光电管(可将光能转变为可以放大检测和记录的电能)和微电流放大器组成。

　　显示器：由放大器和读数元件组成。

　　(3)比色法的定量方法：

　　(i)标准曲线法：将一系列浓度不同的标准溶液按照一定操作过程显色后，分别测吸光度(A)，以A为纵坐标，浓度为横坐标制标准曲线(至少要5点)。在相同条件下处理待测物质并测定其吸光度，即可从标准曲线找出相对应的浓度。

　　(ii)对比法：将标准品与待测样品在相同条件下显色并测定各自的吸光度。由于测定体系温度、厚度及入射光波长一致，故标准与待测样品a&b值相等，可用下式比较计算待测样品浓度Cx=Cs´As/Ax。

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