如何选择蛋白印迹成像与定量分析技术

[2013/3/20]

　　western blot技术在蛋白定量分析中的选择应用

　　蛋白质印迹(western blot)，它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。western blot 是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹(western blot)具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹(western blot)常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。

　　如何选择蛋白印迹成像与定量分析技术?通常，Western Blot显色的方法主要有以下几种：1、放射自显影;2、底物化学发光ECL;3、底物荧光ECF;4、底物DAB呈色等。下面我们将分别对这四种方法进行介绍，同时向大家呈现每种方法的应用特点。

　　放射自显影radioautography：利用放射性核素发射的射线，使感光材料中的卤化银等感光，显出影像后进行放射性标记物的定位和定量测量的技术。此技术的特点是灵敏度高、分辨率好、保存时间长久，但由于实验所用方式性物质对人体有辐射作用，目前该技术在蛋白研究中应用较少，多用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。

　　底物DAB呈色：二氨基联苯胺(Diaminobenzidine,DAB)是辣根过氧化物酶最敏感、最常用的显色底物，反应产物因不溶于水、二甲苯和醇的棕色沉淀物而被广泛地用于蛋白印迹(Western Blot,WB)、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)和免疫细胞化学(Immunocytochemistry,ICC)、斑点印迹(Dot blot)和生物芯片(Biochip)等的染色和显色反应。用之进行对底物显色即被称为底物DAB呈色法。此技术成本低，操作也较简单是常用的western blot成像分析技术之一，不过由于其灵敏度稍低，在目的蛋白表达量较少的情况下可能没有理想的结果应慎用。

　　底物化学发光ECL：化学发光是在一些特殊的化学反应中吸收了反应释放的化学能,而处于电子激发态的反应中间体或反应产物由激发态回到基态时所产生的一种光辐射,化学发光分析是根据化学反应产物的光辐射(化学发光)确定物质含量的一种痕量分析方法。它的特点是灵敏度高和线性范围宽，不需要任何光源。

　　传统的化学发光检测方法通常需要胶片成像，胶片成像可以保证较高的灵敏度，但也有很多缺点：耗时，需要暗房和显影剂，胶片很贵，而且需要很多消耗品，需要持续购买。另外，用胶片上的蛋白条带进行定量也是几乎不可能，和目测一块考马斯蓝染的胶没什么区别，而且胶片成像时间只能预先设定，如果曝光过度或者不足则需要再次进行实验，非常麻烦。

　　数字成像系统的出现极大克服了传统胶片法的一些弊端，近年来随着冷却CCD技术的发展，数字成像系统成本越来越低，成像效果同时获得大大提升，因而CCD成像系统逐渐成为了实验室Western Blot的主要设备。同时目前很多Western blot的新技术也都是针对CCD成像系统的，目前CCD成像系统的灵敏度已经可以达到甚至超过传统的胶片成像。冷却型CCD照相机与X胶片相比具有瞬时影像处理、高灵敏度、高分辨率、动力学范围广等优点，而且还不需要胶片处理装置、后续耗材投入及暗室。

　　底物荧光ECF：是利用的荧光染料(如Cy2 ,Cy3, Cy5)标记二抗，标记荧光染料的二

　　抗分别对应相应的目的蛋白，以此实现通过检测荧光染料的信号强度，实现种蛋白信号的检测，以进行精确的定量分析。荧光检测Western Blot本来不是检测的主流方法，不过荧光法检测允许在同一张转印膜上用不同颜色的荧光底物同时检测不同的目标。

　　在做western blot的检测时，有时会碰到电泳后两个分子量相近的蛋白分离不开，距离相近或者重叠，例如磷酸化和非磷酸化的蛋白;或者是同一次实验中，检测一种以上的蛋白抑或是利用内参蛋白对目的蛋白的定量分析进行标准化。遇到以上这样的实验需求，化学发光的检测方法会显得繁琐复杂，其必须经过剥脱抗体和重行孵育新抗体的过程，不仅耗时费力，而且不能进行精确的定量分析，由此多色荧光成像的技术应运而生。多色荧光成像，是利用不同的荧光染料(如Cy2 ,Cy3, Cy5)标记二抗，标记不同荧光染绕的二抗分别对应不同的目的蛋白，以此实现通过检测不同荧光染料的信号强度，间接实现一次实验可检测多种蛋白，同时也可以进行精确的定量分析。

　　总之，经典的western blot技术结合不断进步的科学技术，使蛋白定量分析更灵敏、操作更加简便。同时，western blot技术仪器也更加专一、高效，这就要求我们在开展western blot实验时，需要就如何选择蛋白印迹成像与定量分析技术进行选择确定，以保证选择工具的适用性。

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