如何定量检测cAMP和cGMP

[2013/3/29]

　　1958年Sutherland发现了cAMP(环磷酸腺苷)，并因此获得了1971年诺贝尔生理与医学奖[1]. 1963年Ashman发现了cGMP(环磷酸鸟苷)[2]。50年过去了，人们已明白cAMP、cGMP是在很多生理过程中发挥重要调节作用的第二信使分子。鸟苷酸环化酶可将GTP催化生成cGMP，cGMP可以被磷酸二酯酶水解成GDP。激活鸟苷酸环化酶和抑制磷酸二酯酶可以增加细胞内cGMP的含量。cGMP特异性磷酸二酯酶的抑制剂被用来治疗人类的某些疾病，比如cGMP特异性磷酸二酯酶类型5的抑制剂(伟哥和西力士)被用来治疗ED(勃起功能障碍);腺苷酸环化酶将ATP催化生成cAMP，cAMP可以被磷酸二酯酶水解成ADP。激活腺苷酸环化酶和抑制磷酸二酯酶可以增加细胞内cAMP的含量。腺苷酸环化酶激活受体的阻断剂和cAMP特异性磷酸二酯酶的抑制剂被用来治疗人类的某些疾病，比如针对升高cAMP水平的b-肾上腺素受体的阻断剂被用于治疗心律失常、高血压、心肌梗塞和心力衰竭等疾病。

　　在五十年的研究历程中，从开始研究cAMP，cGMP在各种生理过程中的调节作用，到近几年与之相关的药物研发，药物筛选领域，人们一直在努力寻找一种快速、灵敏、特异性和可重复地定量检测cAMP和cGMP含量的方法。

　　检测方法演变

　　cAMP，cGMP分子量分别只有329.21和345.21，在机体内的含量极低，为p mol/L级别，用一般的分析方法无法测定。70年代一系列测定cAMP和cGMP的方法被发明出来，最基本的原理有三种：分别是竞争性蛋白质结合分析法[3]、放射性免疫分析法[4]和薄层色谱法[5]。在80年代，放射性免疫分析法得到了广泛的应用和改进，由于这种方法采用放射性核素标记，应用范围受到一定限制，为了进一步提高检测的灵敏度和操作的安全性，进入90年代又陆续发明了各种酶标记法和化学发光法的竞争性ELISA检测试剂盒，这一类检测方法的根本原理都是基于抗体抗原的免疫反应，所有这些试剂盒中采用的抗体全部是兔抗血清或者是经过特异亲和提纯之后的抗cAMP或cGMP的兔多抗，毫无疑问，兔多抗在约四十年的cAMP，cGMP定量检测中做出了巨大贡献，但同时它也有着明显的缺陷：

　　1，兔多抗对cAMP，cGMP的特异性不高，会与其他核苷类似分子发生交叉反应，尽管可以通过特异亲和提纯降低交叉，但仍然无法消除交叉;

　　2，兔多抗对cAMP和cGMP的亲和力受高浓度的二价阳离子(比如Mg2+和Ca2+)的影响;

　　3，兔多抗在制备的过程中存在个体差异和批间差异，难以保证检测数据的重复性;

　　4，兔多抗试剂盒在cAMP，cGMP样品的处理上也需要进行乙酰化处理，这与兔多克隆抗体制备方法有必然关系，如果不乙酰化将无法达到检测所需的灵敏度。

　　所以无论标记方法如何革新，不改进抗体，仍然不能从根本上迎来cAMP，cGMP定量检测的变革。

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