细胞冻存与复苏方法

[2013/7/9]

　　细胞冻存方法

　　1.细胞：选对数生长期细胞，收集细胞24小时前换液一次。

　　2.计数：按常规方法把细胞制成细胞悬液，计数，令细胞密度达5×106/ml，离心去上清，吸入离心管中。

　　3.冻存液：先用培养液9分+DMSO1分(或甘油)配成10%的DMSO冻存液，按上法一滴滴加入离心管中，然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬。

　　4.分装：分装入无菌安剖中，每安剖加1.5毫升细胞悬液。

　　5.封口：用塑料安剖时拧紧瓶口即可;如用火焰封闭安剖口后，仔细检查，定要封严，必要时可浸入蓝色液中观察，为安全起见，把安剖缝入纱布小袋中，以防液氮浸入后，融解时因受热发生爆炸伤人;纱袋一端系以线绳，末端扎有小牌，注明：细胞名称，冻存日期，以便日后查找。

　　细胞复苏方法

　　1.从液氮罐中取出安剖;有时因安剖未封严，浸入了液氮，取出后因安剖内液氮迅速气化而发生爆炸，因此应带有防护眼睛和手套。

　　2.迅速放入盛有36℃～37℃水的搪瓷罐中，扣上盖并不时摇动，尽快解冻。

　　3.剪开纱布口袋，取出安剖，用70%酒精擦拭消毒后，净化台上打开盖，用吸管吸出细胞悬液，装入离心管中，再补加10ml培养液，吹打使细胞悬浮。

　　4.低速离心(500～1000转/分)5分钟，取上清后再重复用培养液漂洗、离心。

　　5.加入培养液适当稀释后，再移装入培养瓶中，置温箱培养，次日更换一次培养液后再继续培养。

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