肉类中三聚氰胺的检测方案

[2013/7/16]

　　酶联免疫吸附测定法定量测定三聚氰胺残留。利用萃取液通过均质及振荡的方式提取样品中的三聚氰胺进行免疫测定。先将三聚氰胺酶标记物，样品萃取物及标准加入到已经包被有三聚氰胺抗体的微孔中开始反应。在30分钟的孵育过程中，样品萃取物中的三聚氰胺与三聚氰胺酶标记物竞争结合微孔中的三聚氰胺抗体，孵育30分钟后洗掉小孔中所有没有结合的三聚氰胺及三聚氰胺酶标记物。再用去离子水清洗结束后，每孔中加入清澈的底物溶液，结合的酶标记物将无色的底物转化为蓝色的物质。孵育30分钟后停止此反应，根据各孔颜色深浅进行数据读取。依据标准的颜色得出样品中三聚氰胺的的浓度值。

　　需要准备的材料：

　　1、蒸馏水或去离子水

　　2、可吸取50ul和100ul的移液器及吸头

　　3、4000转离心机

　　4、吸水纸或相当的吸水材料

　　5、450nm的酶标仪

　　6、计时器

　　7、20mM PBS：需自行配制

　　8、清洗液：需自行配制

　　试剂配制：

　　1、20mM PBS： 0.62g NaH2PO4·2H2O+5.73g Na2HPO4·12H2O+9g NaCl，蒸馏水定容至1000ml

　　2、清洗液： 0.62g NaH2PO4·2H2O+5.73g Na2HPO4·12H2O+9g NaCl，蒸馏水定容至1000ml.+0.5ml 土温20

　　样品的前处理：肉类(稀释倍数：5)

　　1、称1g肉样，加入5ml的10%甲醇/20Mmpbs，震荡2min;

　　2、 4000转离心5min;

　　3、取2ml 上清液加入2ml异辛烷：氯仿(2：3)，混匀;

　　4、 4000转离心5min，取上层150ul测定。[/b]

　　测定过程：

　　1、将所有试剂及样品回升至室温20-28℃，但不要放置超过24小时;

　　2、从铝箔袋中拿出要求数量的微孔条固定在微孔板架上，未使用的孔条与干燥剂一同放入密封袋中保存;

　　3、吸取150ul标准品、样品到对应微孔中，必须保证每种溶液使用干净的吸头吸取，避免交叉污染。加入

　　50ul三聚氰胺酶标记物到每个小孔中;

　　4、轻轻摇板60秒，20-28摄氏度下孵育30分钟;

　　5、将微孔中的溶液倒入水槽中，用清洗液完全充满微孔，震荡后倒掉，重复三次，总共四次洗板;

　　6、最后一次清洗完后，倒掉孔中溶液，然后翻转微孔板在吸水纸上拍干;

　　7、每个微孔中加入100ul底物溶液;

　　8、20-28摄氏度下，孵育30分钟;

　　9、每个微孔中加入100ul停止液;

　　10、450nm下读板。

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