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过氧化氢酶测定步骤
[2013/7/24]
过氧化氢酶
测定步骤：
(1)SOD提取：
称取5g大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎细胞，加入15mL的PH7.8 0.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解，6000rpm离心，弃去沉淀，得上清液。(留出1mL备用，准确量取剩余上清液体积，记录)
(2)除杂蛋白：
提取液加入1/4体积的氯仿-乙醇混合液搅拌10min，6000rpm离心15min去沉淀，得粗酶液。(取1mL粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积)
(3)SOD酶的沉淀分离：
剩余的粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000rpm离心15min，得到SOD酶沉淀。将沉淀先加2mL磷酸缓冲液，溶解后再加3mL混匀。6000rpm离心15min，取上清得到SOD酶液。取1mL备用，其余量取体积。
(4)粗酶液活性测定：
提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测，具体步骤如下。
加入邻苯三酚后迅速混匀，准确计时4min，加一滴浓盐酸停止反应，420nm测吸光值。
试剂/(mL)
空白管
对照管OD1
提取液OD2
粗酶液OD2
酶液OD2
PH8.3缓冲液
3
3
3
3
3
SOD提取液
0
0
0.1
0.1
0.1
蒸馏水
2
1.8
1.7
1.7
1.7
室温放置20min
邻苯三酚
0
0.2
0.2
0.2
0.2
(5)溶液中可溶性蛋白含量测定：
分别从1mL备用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3mL按以下倍数稀释，260nm/280nm测定吸光值，按公式计算蛋白质浓度。
提取液稀释：50 ×
粗酶液稀释：20 ×
酶液稀释：10 ×
测定步骤：
(1)SOD提取：
称取5g大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎细胞，加入15mL的PH7.8 0.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解，6000rpm离心，弃去沉淀，得上清液。(留出1mL备用，准确量取剩余上清液体积，记录)
(2)除杂蛋白：
提取液加入1/4体积的氯仿-乙醇混合液搅拌10min，6000rpm离心15min去沉淀，得粗酶液。(取1mL粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积)
(3)SOD酶的沉淀分离：
剩余的粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000rpm离心15min，得到SOD酶沉淀。将沉淀先加2mL磷酸缓冲液，溶解后再加3mL混匀。6000rpm离心15min，取上清得到SOD酶液。取1mL备用，其余量取体积。
(4)粗酶液活性测定：
提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测，具体步骤如下。
加入邻苯三酚后迅速混匀，准确计时4min，加一滴浓盐酸停止反应，420nm测吸光值。
试剂/(mL)
空白管
对照管OD1
提取液OD2
粗酶液OD2
酶液OD2
PH8.3缓冲液
3
3
3
3
3
SOD提取液
0
0
0.1
0.1
0.1
蒸馏水
2
1.8
1.7
1.7
1.7
室温放置20min
邻苯三酚
0
0.2
0.2
0.2
0.2
(5)溶液中可溶性蛋白含量测定：
分别从1mL备用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3mL按以下倍数稀释，260nm/280nm测定吸光值，按公式计算蛋白质浓度。
提取液稀释：50 ×
粗酶液稀释：20 ×
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