原位杂交实验步骤
[2013/7/29]
原位杂交实验步骤
一质粒制备
1质粒的转化和扩增
1.1制备XL1-Blue感受态细菌
1. 取400uL XL1-Blue菌种加入到含200ml LB培养基的锥形瓶中，37 ℃、100
rpm培养4h，离心，倒置，以冰冷的0.1 mol/L CaCl_2重悬细菌，冰浴30 min，
离心，弃上清，倒置，再加4ml(含15%甘油)冰冷的CaCl2重悬细菌，分装(200 μ/tube)，-80 ℃保存。
2. 转化：在冰浴中将1管XL1-Blue感受态菌解冻，将浓度为2ng/μ1的质粒DNA4μ1加入到8Oμ1感受态菌中。
3. 轻轻摇匀，冰浴30 min。
4.42 ℃热激9O秒，然后迅速冰浴2 min。
5. 加入LB培养液(无氨苄青霉素)0.8ml，在37 ℃，100转/min水浴孵育60 min。
6.取200μl菌液铺于琼脂板上(涂有X-Gal(20mg/ml)-IPTG(200mg/ml)的
LB-氨苄青霉素50 mg/ml,1μl/ml培养基)，待菌液全部被吸收后，倒置平板于37 ℃培养12-16h。
1.2鉴定和挑选含重组质粒的菌落
1. 用无菌牙签挑取单菌落，接种到10 ml含氨苄青霉素的LB培养液的离心管中，于37 ℃，200转/分培养2h，取1 ml之一Eppendorf离心管，加50μl10mmol/L EDTA(pH 8.0)。
2. 加入50μl新配置的0.2mol/L NaOH、0.5%SDS、20%蔗糖溶液后，振荡3O秒。
3. 在70 ℃温育5 min，然后冷却到室温。
4. 加1.5μ14mol/L KCl和0.5μ1含0.4%溴酚兰染液，振荡3O秒后，冰浴5min。
5. 12000g，4 ℃离以 3 min，以除去细菌碎片。
6. 制备1%的琼脂糖凝胶(含EB0.5μg/ml)，取50μl上清液加入到样品孔中，其中一孔加入中等分子量DNA Marker。恒压50V，进行电泳。
7. 当溴酚兰迁移到凝胶全长的2/3-3/4时，停止电泳，在紫外灯下检查质粒DNA分于量的大小是否与转入质粒相符。
1.3质粒的扩增和纯化
1. 用无菌牙签分别挑取单个白色菌落移入含30ml LB-氨苄青霉素(50μg/ml)培养液的聚丙烯管中，于37 ℃，200转/分培养3h。
2. 将菌液转入含70 ml LB-氨苄青霉素培养液的250ml锥形瓶中，37 ℃，200转/分培养过夜(12-16h)，细菌浑浊。
3. 菌液中加入氯霉素液(34mg溶于lml乙醇，100ml菌液加入0.5ml氯霉素溶液，终浓度为170 μ/ml)。37 ℃，200转/分培养12-16h。
4. 将培养的细菌倒入50ml的离心管中，6000rpm，4 ℃离,th,15 min，沉淀细菌。
5. 弃净上清夜，用2ml预冷的溶液I，悬浮菌体沉淀，剧烈振荡，于室温静置5 min
6. 加入新配制的溶液II 4ml，快速用手晃动10秒，颠倒数次后，于室温静置10 min。
7. 加入预冷的溶液III 3ml，温和振荡l0秒，于冰上静置10 min，出现白色絮状沉淀。
8. 6000rpm，4 ℃离心15 min，保留上清。
9. 将上清(若带细菌残片，则再次离心)移入另一50ml的离心管中，加入O.6倍体积的异丙醇混匀，于室温静置10 min。(或-20 ℃4h，或4 ℃过夜，可便核酸沉淀)
10.12000 rpm，4 ℃离心15 min，回收核酸。小心弃去上清，倒置离心管使残兼上清液流尽。
11.于室温用70%的乙醇洗涤沉淀物和管壁，室温12000 rpm离心，15 min，充分弃去乙醇，于室温将离心管倒置在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。
12.用500μl TE(pH8.0)溶解核酸沉淀，转移至1.5 ml Eppendorf管中。
13.加入用冰预冷的5mol/L的LiCl溶液600μl，充分混匀。12000 rpm，4 ℃离心15 min，以沉淀高分子量的RNA。
14.将上清转移到另一1.5 ml Eppendorf管中，加等量异丙醇，充分混匀，于室温静置10min。
15.12000 rpm,4 ℃离心15 min，回收核酸。小心弃去上清，倒置离心管使残余上清液流尽。
16.于室温用70%的乙醇洗涤沉淀物和管壁，室温12000 rpm离心，15 min，充分弃去乙醇，于室温将离心管倒置在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。
17.400μl含无DNA酶的RNA酶(20μg/ml)的TE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀，将溶液转移到另-1.5 ml Eppendorf管中，室温放置1.5ml Eppendorf管中30min。
18.加入400μl 13%(v/v)的PEG 8000-NaCl(1.6 mol/L)，混匀，4 ℃ 12000rpm离心5 min以回收质粒DNA，弃去上清。
19.加入400μl TE缓冲液(pH 8.O)溶解沉淀，再分别用等体积的Tris饱和酚、酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)、和氯仿各抽提一次。
20.将水相(上清)移入另一1.5ml Eppendorf管中，加入O.1体积(约50μ13M的醋酸钠(pH 5.2)和2倍体积(大约1 ml)的无水乙醇，充分混匀后于4℃放置30 min。
21.于4 ℃ 12000 rpm离心5 min回收沉淀的质粒DNA。尽可能弃去上清，敞开管口，置工作台上使残留的痕量乙醇蒸发殆尽。
22.加入400 μl处于4 ℃的70%乙醇，稍加振荡，漂洗沉淀，4 ℃ 12000 rpm离心2 min。
23.吸去上清，室温敞开管口，直到乙醇完全挥发。
24.用100μl TE缓冲液(pH 8.0)溶解沉淀。
25.取4μl溶液1：100稀释后，测定其OD260、OD280，以确定质粒DNA的纯度和浓度(OD260/OD280>1.8。OD260/OD280对DNA而言其值大约为
1.8，高于2.0则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。;DNA浓度=OD260 X 0.05 X稀释倍数(μg/μl)。
26.质粒DNA溶液于-20 ℃保存待用。
二、cRNA探针的标记
1. 将质粒DNA，用相应的限制性内切酶线性化，通过琼脂糖凝胶电泳以确保完全线性化。
2. 线性化后的DNA按“质粒的纯化”步骤19-24进行纯化，作为cRNA探针标记的模板，用相应的RNA聚合酶合成地高辛标记的反义和正义RNA探针。
3. 进行体外转录，步骤如下：
4. 在冰上将各试剂加入一1.5 ml无RNA酶的Eppendorf管中。DEPC处理的三蒸水8μl质粒DNA模板 0.05μg/μl
1μl10 x NTP地高辛标记混合物 1 x
2μl0.1 M DTT溶液 10 mM
2μl5 x转录缓冲液 1 x
4μlRNAse抑制剂 2U/μl
1μlRNA聚合酶 2U/μl
2μl反应体系总体积 20μl
5. 加入上述各试剂后，混匀，简短离心后在37 ℃孵育2h。
6. 加入2μl无RNA酶的DNA酶I(10U/μ1)，37 ℃孵育15 min降解模板DNA。
7. 加入0.2M EDTA(pH 8.0)溶液2μl终止反应。
8. 加入2.5μl的4 M Licl和7.5μl冷的无水乙醇，混匀，-20 ℃放置2h。
9. 12000g下离以 15 min，弃上清，小心地用50 μl冷的70%乙醇洗涤沉淀。
1O.室温下稍干燥，溶于100μ1 DEPC处理过的三蒸水中，混匀分装，-20 ℃下保持备用。
三、原位杂交
3.1冰冻切片与杂交前预处理
1. 将子宫样品从-80 ℃取出，用OCT包埋，在-23 ℃(切片机腔体温度)平衡至少30 min。将包埋好的样品固定在样品头上，切10μm厚的连续组织切片，平铺于涂有多聚赖氨酸(1mg/m1)的玻片上(玻片预先经180 ℃干烤6小时)，保存于-70 ℃冰柜备用。
2. 冰冻切片经室温干燥10 min后，在4%的多聚甲醛-PBS(pH 7.4)固定lOmin
3. 活跃的DEPC-PBS(未高压的0.1%DEPC-1XPBS溶液)洗2次，每次5 min。
4. 在0.2M的盐酸作用中作用10 min后，重复步骤4)。
5. 在切片上滴加蛋白酶K(0.1μg/m1)，37 ℃孵育15 min，重复步骤4)。
6. 经0.1M TEA(三乙醇胺)作用5min后，再在新配制的0.25%AA/0.1M TEA(乙酸酐/三乙醇胺，pH 8.0)中乙酰化10 min。(在大多数实验中，步骤4，5，6省略)
7. 5 x SSC中平衡15 min。
3.2杂交
8. 在脱水后的玻片上滴加预杂交液(约100 μl/玻片)，置于放有湿盒液(50%甲酰胺v/v;0.3 M NaCl;1Mm EDTA;10 mM Tris-Cl，pH 8.O)的湿盒中，55～58 ℃下的烘箱中预杂交2 h。
9. 甩掉预杂交液，地高辛标记的反义或正义cRNA探针(浓度1-2ng/μl)经70 ℃变性1O分钟，置冰上1 min，玻片上滴加预杂交液(约60μl/玻片)，覆盖parafilm膜，放湿盒中在48～58 ℃下杂交18-30 h。
3.3杂交后处理
1O.取出玻片，小心去掉Parafilm膜，甩掉杂交液，用52 ℃预热的5×SSC洗30 min。
11.在无DNA的RNA酶A(20μg/ml)溶液中37 ℃下孵育30 min。
12.分别依次用52 ℃预热的2 X SSC，1 X SSC和O.1 X SSC洗2次，每次30 min。
3.4杂交信号检测
13.在缓冲液A(0.1M Tris-HC 1 pH 7.5，0.15M NaC1)中平衡5min。
14.在玻片上滴加碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(1：500～1:2000稀释于含0.5%阻断液的缓冲液A中)，室温反应2h。
15.用缓冲液A洗2次，每次15 min。
16.在缓冲液B(0.1M Tris-HCl;0.1M NaCl;0.05M MgCl_2，pH 9.5)中平衡5min。
17.硝基四氮唑蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚氧磷酸盐(BCIP)溶于缓冲液B中，每ml缓冲液B含有4.5μ1 NBT和3.5μ1 BCIP。在玻片上滴加混合染液在湿盒中显色过夜。
18.充分显色后，用EDTA(1 mM EDTA，pH 8.0)洗15 min终止反应。
19.在95%乙醇中洗l h以除去非特异的背景。
20.用蒸馏水洗15 min除去可能存在的结晶体。
21.脱水、透明，用中性树胶封片。
22.充分干燥后在显微镜下观察、照相。
一质粒制备
1质粒的转化和扩增
1.1制备XL1-Blue感受态细菌
1. 取400uL XL1-Blue菌种加入到含200ml LB培养基的锥形瓶中，37 ℃、100
rpm培养4h，离心，倒置，以冰冷的0.1 mol/L CaCl_2重悬细菌，冰浴30 min，
离心，弃上清，倒置，再加4ml(含15%甘油)冰冷的CaCl2重悬细菌，分装(200 μ/tube)，-80 ℃保存。
2. 转化：在冰浴中将1管XL1-Blue感受态菌解冻，将浓度为2ng/μ1的质粒DNA4μ1加入到8Oμ1感受态菌中。
3. 轻轻摇匀，冰浴30 min。
4.42 ℃热激9O秒，然后迅速冰浴2 min。
5. 加入LB培养液(无氨苄青霉素)0.8ml，在37 ℃，100转/min水浴孵育60 min。
6.取200μl菌液铺于琼脂板上(涂有X-Gal(20mg/ml)-IPTG(200mg/ml)的
LB-氨苄青霉素50 mg/ml,1μl/ml培养基)，待菌液全部被吸收后，倒置平板于37 ℃培养12-16h。
1.2鉴定和挑选含重组质粒的菌落
1. 用无菌牙签挑取单菌落，接种到10 ml含氨苄青霉素的LB培养液的离心管中，于37 ℃，200转/分培养2h，取1 ml之一Eppendorf离心管，加50μl10mmol/L EDTA(pH 8.0)。
2. 加入50μl新配置的0.2mol/L NaOH、0.5%SDS、20%蔗糖溶液后，振荡3O秒。
3. 在70 ℃温育5 min，然后冷却到室温。
4. 加1.5μ14mol/L KCl和0.5μ1含0.4%溴酚兰染液，振荡3O秒后，冰浴5min。
5. 12000g，4 ℃离以 3 min，以除去细菌碎片。
6. 制备1%的琼脂糖凝胶(含EB0.5μg/ml)，取50μl上清液加入到样品孔中，其中一孔加入中等分子量DNA Marker。恒压50V，进行电泳。
7. 当溴酚兰迁移到凝胶全长的2/3-3/4时，停止电泳，在紫外灯下检查质粒DNA分于量的大小是否与转入质粒相符。
1.3质粒的扩增和纯化
1. 用无菌牙签分别挑取单个白色菌落移入含30ml LB-氨苄青霉素(50μg/ml)培养液的聚丙烯管中，于37 ℃，200转/分培养3h。
2. 将菌液转入含70 ml LB-氨苄青霉素培养液的250ml锥形瓶中，37 ℃，200转/分培养过夜(12-16h)，细菌浑浊。
3. 菌液中加入氯霉素液(34mg溶于lml乙醇，100ml菌液加入0.5ml氯霉素溶液，终浓度为170 μ/ml)。37 ℃，200转/分培养12-16h。
4. 将培养的细菌倒入50ml的离心管中，6000rpm，4 ℃离,th,15 min，沉淀细菌。
5. 弃净上清夜，用2ml预冷的溶液I，悬浮菌体沉淀，剧烈振荡，于室温静置5 min
6. 加入新配制的溶液II 4ml，快速用手晃动10秒，颠倒数次后，于室温静置10 min。
7. 加入预冷的溶液III 3ml，温和振荡l0秒，于冰上静置10 min，出现白色絮状沉淀。
8. 6000rpm，4 ℃离心15 min，保留上清。
9. 将上清(若带细菌残片，则再次离心)移入另一50ml的离心管中，加入O.6倍体积的异丙醇混匀，于室温静置10 min。(或-20 ℃4h，或4 ℃过夜，可便核酸沉淀)
10.12000 rpm，4 ℃离心15 min，回收核酸。小心弃去上清，倒置离心管使残兼上清液流尽。
11.于室温用70%的乙醇洗涤沉淀物和管壁，室温12000 rpm离心，15 min，充分弃去乙醇，于室温将离心管倒置在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。
12.用500μl TE(pH8.0)溶解核酸沉淀，转移至1.5 ml Eppendorf管中。
13.加入用冰预冷的5mol/L的LiCl溶液600μl，充分混匀。12000 rpm，4 ℃离心15 min，以沉淀高分子量的RNA。
14.将上清转移到另一1.5 ml Eppendorf管中，加等量异丙醇，充分混匀，于室温静置10min。
15.12000 rpm,4 ℃离心15 min，回收核酸。小心弃去上清，倒置离心管使残余上清液流尽。
16.于室温用70%的乙醇洗涤沉淀物和管壁，室温12000 rpm离心，15 min，充分弃去乙醇，于室温将离心管倒置在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。
17.400μl含无DNA酶的RNA酶(20μg/ml)的TE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀，将溶液转移到另-1.5 ml Eppendorf管中，室温放置1.5ml Eppendorf管中30min。
18.加入400μl 13%(v/v)的PEG 8000-NaCl(1.6 mol/L)，混匀，4 ℃ 12000rpm离心5 min以回收质粒DNA，弃去上清。
19.加入400μl TE缓冲液(pH 8.O)溶解沉淀，再分别用等体积的Tris饱和酚、酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)、和氯仿各抽提一次。
20.将水相(上清)移入另一1.5ml Eppendorf管中，加入O.1体积(约50μ13M的醋酸钠(pH 5.2)和2倍体积(大约1 ml)的无水乙醇，充分混匀后于4℃放置30 min。
21.于4 ℃ 12000 rpm离心5 min回收沉淀的质粒DNA。尽可能弃去上清，敞开管口，置工作台上使残留的痕量乙醇蒸发殆尽。
22.加入400 μl处于4 ℃的70%乙醇，稍加振荡，漂洗沉淀，4 ℃ 12000 rpm离心2 min。
23.吸去上清，室温敞开管口，直到乙醇完全挥发。
24.用100μl TE缓冲液(pH 8.0)溶解沉淀。
25.取4μl溶液1：100稀释后，测定其OD260、OD280，以确定质粒DNA的纯度和浓度(OD260/OD280>1.8。OD260/OD280对DNA而言其值大约为
1.8，高于2.0则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。;DNA浓度=OD260 X 0.05 X稀释倍数(μg/μl)。
26.质粒DNA溶液于-20 ℃保存待用。
二、cRNA探针的标记
1. 将质粒DNA，用相应的限制性内切酶线性化，通过琼脂糖凝胶电泳以确保完全线性化。
2. 线性化后的DNA按“质粒的纯化”步骤19-24进行纯化，作为cRNA探针标记的模板，用相应的RNA聚合酶合成地高辛标记的反义和正义RNA探针。
3. 进行体外转录，步骤如下：
4. 在冰上将各试剂加入一1.5 ml无RNA酶的Eppendorf管中。DEPC处理的三蒸水8μl质粒DNA模板 0.05μg/μl
1μl10 x NTP地高辛标记混合物 1 x
2μl0.1 M DTT溶液 10 mM
2μl5 x转录缓冲液 1 x
4μlRNAse抑制剂 2U/μl
1μlRNA聚合酶 2U/μl
2μl反应体系总体积 20μl
5. 加入上述各试剂后，混匀，简短离心后在37 ℃孵育2h。
6. 加入2μl无RNA酶的DNA酶I(10U/μ1)，37 ℃孵育15 min降解模板DNA。
7. 加入0.2M EDTA(pH 8.0)溶液2μl终止反应。
8. 加入2.5μl的4 M Licl和7.5μl冷的无水乙醇，混匀，-20 ℃放置2h。
9. 12000g下离以 15 min，弃上清，小心地用50 μl冷的70%乙醇洗涤沉淀。
1O.室温下稍干燥，溶于100μ1 DEPC处理过的三蒸水中，混匀分装，-20 ℃下保持备用。
三、原位杂交
3.1冰冻切片与杂交前预处理
1. 将子宫样品从-80 ℃取出，用OCT包埋，在-23 ℃(切片机腔体温度)平衡至少30 min。将包埋好的样品固定在样品头上，切10μm厚的连续组织切片，平铺于涂有多聚赖氨酸(1mg/m1)的玻片上(玻片预先经180 ℃干烤6小时)，保存于-70 ℃冰柜备用。
2. 冰冻切片经室温干燥10 min后，在4%的多聚甲醛-PBS(pH 7.4)固定lOmin
3. 活跃的DEPC-PBS(未高压的0.1%DEPC-1XPBS溶液)洗2次，每次5 min。
4. 在0.2M的盐酸作用中作用10 min后，重复步骤4)。
5. 在切片上滴加蛋白酶K(0.1μg/m1)，37 ℃孵育15 min，重复步骤4)。
6. 经0.1M TEA(三乙醇胺)作用5min后，再在新配制的0.25%AA/0.1M TEA(乙酸酐/三乙醇胺，pH 8.0)中乙酰化10 min。(在大多数实验中，步骤4，5，6省略)
7. 5 x SSC中平衡15 min。
3.2杂交
8. 在脱水后的玻片上滴加预杂交液(约100 μl/玻片)，置于放有湿盒液(50%甲酰胺v/v;0.3 M NaCl;1Mm EDTA;10 mM Tris-Cl，pH 8.O)的湿盒中，55～58 ℃下的烘箱中预杂交2 h。
9. 甩掉预杂交液，地高辛标记的反义或正义cRNA探针(浓度1-2ng/μl)经70 ℃变性1O分钟，置冰上1 min，玻片上滴加预杂交液(约60μl/玻片)，覆盖parafilm膜，放湿盒中在48～58 ℃下杂交18-30 h。
3.3杂交后处理
1O.取出玻片，小心去掉Parafilm膜，甩掉杂交液，用52 ℃预热的5×SSC洗30 min。
11.在无DNA的RNA酶A(20μg/ml)溶液中37 ℃下孵育30 min。
12.分别依次用52 ℃预热的2 X SSC，1 X SSC和O.1 X SSC洗2次，每次30 min。
3.4杂交信号检测
13.在缓冲液A(0.1M Tris-HC 1 pH 7.5，0.15M NaC1)中平衡5min。
14.在玻片上滴加碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(1：500～1:2000稀释于含0.5%阻断液的缓冲液A中)，室温反应2h。
15.用缓冲液A洗2次，每次15 min。
16.在缓冲液B(0.1M Tris-HCl;0.1M NaCl;0.05M MgCl_2，pH 9.5)中平衡5min。
17.硝基四氮唑蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚氧磷酸盐(BCIP)溶于缓冲液B中，每ml缓冲液B含有4.5μ1 NBT和3.5μ1 BCIP。在玻片上滴加混合染液在湿盒中显色过夜。
18.充分显色后，用EDTA(1 mM EDTA，pH 8.0)洗15 min终止反应。
19.在95%乙醇中洗l h以除去非特异的背景。
20.用蒸馏水洗15 min除去可能存在的结晶体。
21.脱水、透明，用中性树胶封片。
22.充分干燥后在显微镜下观察、照相。
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