细胞培养过程有哪些污染及怎样减少污染

[2013/8/27]

　　细胞培养中的污染分为两类，化学污染和生物污染。

　　化学污染

　　化学污染是一些对细胞有毒性的或对细胞产生刺激的化学物质。这些污染一般来自于没有洗净的器皿、不纯的化学试剂和质量较差的蒸馏水等。

　　化学污染中比较引人注意的是细菌内毒素。它是革兰氏阴性细菌细胞死亡后解体释放出的疏水性的细胞壁组成物质，对塑料等疏水性强的物质有很强的吸附能力。细菌内毒素可刺激部分细胞产生一些激素或细胞因子，对细胞生长和实验结果产生影响。细菌内毒素是临床上的最主要的热原(即注射到动物体内会导致动物发热)，所以通过细胞培养生产的疫苗、细胞因子等用在临床上的药品的生产过程中更是要避免细菌内毒素的污染。

　　生物污染

　　生物污染包括比较容易发现的细菌、霉菌和酵母的污染，和较难发现的病毒、支原体和其他细胞的污染。

　　细菌、霉菌和酵母到处存在，它们能在合适的环境中非常快速的生长。这些污染比较容易观察到，它们往往会使其污染的培养液产生可见的变化，或者通过显微镜观察就可以看见。

　　· 由于病毒有种属特异性，所以病毒污染的概率比较小。但是病毒污染难于发现，因为病毒颗粒特别微小，一般的实验室都没能力检查细胞培养中污染的病毒。由于病毒一般潜伏在细胞内，对整个细胞培养不是致死的，所以它可能会使研究人员长期得到受病毒影响的细胞的实验结果。

　　1956 年 Robinson 及其同事首次发现细胞培养中的支原体污染。90年代初美国的一个调查发现，在该国的细胞培养中，至少有15%被支原体污染。由于支原体没有细胞壁，在细胞培养液中几乎是透明的，同时对常用于细胞培养中的抗生素不敏感，不引起 pH 变化，不使培养液浑浊，所以支原体污染不容易被发现，但是其存在会影响实验的结果。

　　细胞的交叉污染在细胞培养中发生的严重程度大大超过人们的想象：1981 年对ATCC细胞株的调查显示：超过 60 标记为其他细胞株的细胞居然是 HeLa 细胞。

　　怎么样才能减少污染的机会?

　　减少化学污染

　　对于自己用粉末配制培养液的实验室来说，配制培养液要使用重蒸馏水，以减少带入化学污染的机会。如果要添加NaHCO3，要选用纯度高的NaHCO3，最好是经过细胞培养测试的。

　　· 由于病毒有种属特异性，所以病毒污染的概率比较小。但是病毒污染难于发现，因为病毒颗粒特别微小，一般的实验室都没能力检查细胞培养中污染的病毒。由于病毒一般潜伏在细胞内，对整个细胞培养不是致死的，所以它可能会使研究人员长期得到受病毒影响的细胞的实验结果。

　　1956 年 Robinson 及其同事首次发现细胞培养中的支原体污染。90年代初美国的一个调查发现，在该国的细胞培养中，至少有15%被支原体污染。由于支原体没有细胞壁，在细胞培养液中几乎是透明的，同时对常用于细胞培养中的抗生素不敏感，不引起 pH 变化，不使培养液浑浊，所以支原体污染不容易被发现，但是其存在会影响实验的结果。

　　细胞的交叉污染在细胞培养中发生的严重程度大大超过人们的想象：1981 年对ATCC细胞株的调查显示：超过 60 标记为其他细胞株的细胞居然是 HeLa 细胞。

　　怎么样才能减少污染的机会?

　　减少化学污染

　　对于自己用粉末配制培养液的实验室来说，配制培养液要使用重蒸馏水，以减少带入化学污染的机会。如果要添加NaHCO3，要选用纯度高的NaHCO3，最好是经过细胞培养测试的。

　　· 另外尽量使用一次性的细胞培养器皿。由于标准厂家一次性细胞培养器皿的生产环境比较严格，得到的产品洁净度很高，从而减少了由细胞培养器皿带入污染的机会。

　　减少生物污染

　　由于一般的污染发生在细胞培养的操作过程中，所以良好的细胞培养操作环境和操作习惯是减少生物污染的关键。

　　要用一个专门的房间用于细胞培养，注意保持房间的清洁。

　　要有一个定期检验的合格的超净台(超净台内的洁净度应该为100级，与计算机硬盘的生产环境相当)。在使用超净台前开启通风装置并打开紫外灯灭菌30分钟。操作时要戴一次性橡胶手套，并喷洒70%酒精消毒。任何带入超净台的非无菌物件都要喷洒70%酒精消毒。收集废培养液的瓶子要加入漂白液，以避免微生物的生长。每次实验完后，要向通向废培养液瓶的塑料管内喷洒70%酒精，并且用蒸馏水和70%酒精先后擦拭台面(只用70%酒精擦拭会导致洒落在台面的培养液在台面上形成难以清除的污垢)。

　　不要在超净台里使用酒精灯等灯具，因为这样会因灯的热的火焰引起的空气对流而破坏超净台里本来规则的空气层流，使本来存在于超净台底层的微粒被带到上层，带来更多的污染机会。

　　·加热培养液的37°C恒温水浴中非常容易有微生物的生长，从而成为一个重要的污染源。所以需要定期清洗恒温水浴。细胞培养箱内的用于保持湿度的水盘也需要定期清洗。为了减少不同细胞株间的相互污染，不要用同一瓶培养液或胰酶培养不同的细胞;不要在一个超净台上同时进行多种细胞的操作。　　分装每次小量使用的溶液(如胰酶、抗生素、谷氨酸溶液)，以减少多次使用时污染的机会。

　　以防万一

　　即使再小心，污染难免还是会发生。所以得到一个新的细胞株后的第一件事情，是把细胞生长扩增后冻存起来，以备不测。

　　内毒素是什么?

　　内毒素的化学成分是脂多糖，是革兰氏阴性菌细胞壁的主要组分之一。一个活的细菌很少释放内毒素，但死后可放出大量内毒素。

　　内毒素在血液中存在时会引起动物发热，是医疗注射液中最主要的。19 世纪 40 年代开始用注射溶液引起兔的发热反应实验来检测热原(主要是细菌内毒素)。后来研究者发现鲎(一种海洋生物)血液遇到极微量的内毒素会发生凝血反应，从而在19 世纪 70 年代发明了鲎试剂用于快速精确检测内毒素。内毒素含量一般用国际单位( EU )来衡量，一般来说 1EU 大致等于 0.1-0.2ng。

　　由于内毒素会对很多种细胞产生刺激，影响实验结果，所以在实验中要尽量减少在培养液中的内毒素的来源。

　　由于生产工艺的提高，来自标准厂家的血清和培养液中的内毒素含量很少。所以现代实验室细胞培养中内毒素的来源主要是水、添加剂、细胞培养器皿等。　　传统的玻璃仪器制备的双蒸水和通过离子交换柱、活性炭柱和超滤三个环节的纯水制备仪制备的超纯水都能满足细胞培养用水的要求。盛水器具上的细菌内毒素可能给超纯水带来污染。长时间放置的超纯水也可因盛水器具上细菌生长而污染细菌内毒素。

　　内毒素能紧密的粘在玻璃器皿上，实验室里用普通的方法不能完全的消除除内毒素。用 250 ℃， 30 分钟或 180 ℃， 2 小时干热灭菌能完全除掉玻璃器皿上的内毒素。

　　一次性塑料器皿经过高温注塑成型，没有内毒素存在。但在处理、包装等生产过程中，可能污染内毒素。

　　应该选用什么样的抗生素和相应的浓度?

　　抗生素在五十年代开始细胞培养中得到使用。它大大减少了细胞培养中细菌等微生物污染的机会，从而使细胞培养在普通实验室就可以轻易操作。

　　·最常用的抗生素是苄基青霉素钾盐 (Penicillin G potassium )和链霉素硫酸盐 ( Streptomycin sulphate)的混合液，通称PS。青霉素抑制细菌细胞壁的合成，链霉素则抑制细菌蛋白质的合成。一般青霉素的浓度为10,000U/ml, 链霉素的浓度为10,000ug/ml。青霉素在普通的医院或药店可以买到。链霉素由于对听觉神经具有损害，已经很少用于医疗，所以需要向专门的化学试剂公司购买。

　　有一些培养过程污染源比较多，比如组织培养。为了减少污染，常常需要在培养液中加入其他的抗生素。比如庆大霉素(Gentamycin sulfate，抑制细菌蛋白质的合成)，两性霉素B (amphotericin B，干扰含胆固醇的细胞膜的功能，抑制酵母和真菌的生长，对培养细胞也具有一定的毒性)等。

　　可用于细胞培养的抗生素种类非常多，如果细胞培养过程比较特殊，污染源比较多，可以考虑选用其他的抗生素。

　　即使使用多种抗生素的组合，污染还是有可能发生。所以减少污染的关键，是规范的实验环境和操作。抗生素的使用，也会使一些污染长期潜伏，同时与五十年代抗生素开始引入细胞培养时相比，现在的过滤技术，超净台的质量等都已经有了很大的提高，在培养过程中带入污染的机会大大减小了，所以有不少人建议在普通的细胞培养过程中不要使用抗生素。

　　为什么有人提倡细胞培养液中不要加抗生素?

　　抗生素虽然减少了可以观察到的细菌、酵母等微生物的污染机会，却会增加支原体、病毒等隐性污染的机会。

　　因为细胞培养中污染主要来源于空气中的微粒和汽雾，而这些微粒和汽雾可以同时携带支原体、病毒和其他微生物。当抗生素使用时，可见污染被抑制而隐性污染又没被注意到，这样支原体、病毒等隐性污染的机会反而增加了。Barile的一项研究显示(1)，72%持续使用抗生素培养的细胞有支原体污染，而不使用抗生素培养的细胞支原体污染的比例只有7%。

　　反过来如果不使用抗生素，支原体、病毒的污染往往会伴随细菌和酵母等的污染。由于细菌和酵母等的污染很容易观察到，污染细胞的及时清理就大大减少了支原体、病毒的污染机会。

　　潜在的支原体、病毒的污染会带来很大的危害。这些微生物的存在会影响细胞的理化性质，从而使研究者得到错误的实验结果。在严重的情况下，甚至使一个实验室数年的研究白白浪费。

　　由于过滤技术的提高和超净台质量的改进，在规范的细胞培养操作过程中引进污染的机会已经被大大降低了。所以比较合理的建议是，在常规的细胞培养中不要使用抗生素。只有在培养污染源很多(比如组织培养)，或者培养非常珍贵的细胞株时才使用抗生素。

　　1. Barile, M. F. Mycoplasmal Contamination of Cell Cultures: mycoplasma-Virus-Cell Culture Interactions. in Contamination in Tissue Culture, J. Fogh, ed. (Academic Press, Inc., New York, 1973) 131-171. 38. Perlman, D. Use of Antibiotics in Cell

　　直接培养法检测细胞培养中的支原体污染

　　特点: 最直接最灵敏的检测手段。

　　缺点：培养时间长，需3-5周才能判断。有些支原体不能在培养基上培养出来(例如M. hyorhinis)。需要同时培养支原体菌株作阳性对照，可能会造成污染。

　　材料：葡萄糖、L-盐酸精氨酸、Difco PPLO broth(Difco 0554-17-1)、马血清、15%酵母膏溶液(高压灭菌)、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管(高压灭菌)、无菌培养皿(60x15mm)、玻璃棒、37℃培养箱、厌氧缸(厌氧缸长期培养易有污染，所以厌氧包应该用无菌水，每次打开厌氧缸后用70%酒精擦拭内壁。)

　　培养基准备：基本配方为Difco PPLO broth(60%)，马血清(20%)，15%酵母膏溶液(10%)，10x储存液(10%)。由于培养时间长，可加50u/ml青霉素至10x储存液或加入乙酸铊(1：2000)至培养基中以防止其他细菌的污染。

　　10x储存液(1升)：称取50克葡萄糖，10克L-盐酸精氨酸溶于1升蒸馏水中。用0.22μm无菌过滤膜过滤除菌，分装100ml至瓶中，-70℃保存。

　　液体培养基(1升)：称取21克Difco PPLO broth，0.02克酚红于600ml蒸馏水中加热搅拌溶解。灭菌121℃15分钟灭菌。待温度降低至室温后于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml 15%酵母膏溶液及100ml解冻的10x储存液，混合均匀后分装至已灭菌的有盖螺旋试管中，10ml/管。4℃保存，保存期限为1个月。

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