质粒提取常见问题系统分析

[2013/9/10]

　　未提出质粒或质粒得率较低：

　　△ 大肠杆菌老化

　　请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。

　　△ 质粒拷贝数低

　　由于低使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。

　　△ 菌体中无质粒

　　有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。

　　△ 碱裂解不充分

　　使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液P1、P2和P3的用量。对低拷贝数质粒，提取时，可加倍使用溶液P1、P2和P3，可能有助于增加质粒提取量和质粒质量。

　　△ 溶液使用不当

　　溶液P2、P3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。

　　△ 吸附柱过载

　　不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如TB 或2×YT，菌液体积必须减少;若质粒或宿主菌是非常高的拷贝数或生长率，则需调整LB培养液体积。

　　△ 质粒未全部溶解(尤其质粒较大时)

　　洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。

　　△ 乙醇残留

　　漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，树脂型试剂盒漂洗后应晾干树脂，再加入洗脱缓冲液。

　　△ 洗脱液加入位置不正确

　　洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。

　　△ 洗脱液不合适

　　DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB (10 mM Tris·Cl, pH 8.5)或水。洗脱效率取决于pH值。最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用有利于提高洗脱效率。

　　△ 洗脱体积太小

　　洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。

　　△ 洗脱时间过短

　　洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置一分钟可达到较好的效果。

　　■ 质粒纯度不高：

　　△ 混有蛋白

　　不要使用过多菌体。溶液P1、P2、P3处理并离心后溶液应为澄清的，如果还混有微小蛋白悬浮物，可再次离心去除后再进行下一步骤。

　　△ 混有RNA

　　RNase A处理不彻底，请减少菌体用量或加入溶液P3之后室温放置一段时间。如果溶液P1已保存6个月以上，请在溶液P1中添加RNase A。

　　△ 混有基因组DNA

　　加入溶液P2和P3后应温和混匀，如果剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。如果加入溶液P2后过于粘稠，无法温和混匀，请减少菌体用量。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，不要超过16 小时。

　　△ P3溶液加入时间过长

　　P3溶液加入后，放置时间不要太长，否则有可能会产生小片段DNA污染。

　　△ 含大量核酸酶的宿主菌

　　宿主菌含大量核酸酶，在质粒提取过程中降解质粒DNA，影响提取质粒DNA的完整性，最好选用不含核酸酶的大肠杆菌宿主菌，如DH5α和Top10。

　　△ 裂解时间过长

　　加入溶液P2后裂解时间不应超过5分钟。

　　△ 质粒的二聚体和多聚体形式

　　质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出。

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