细胞染色方法总结

[2013/9/17]

　　hoechest33342和hoechst33258两种(主要为凋亡活细胞)在紫外光下将核染为蓝色。Hoechst染细胞核会影响共聚焦显微镜对该样本其他荧光的观察效果。hoechsthoechsts33258，hoechst33342二者区别不大，但是hoechst33342对细胞的毒性作用更小一些，所以一般来说hoechsts33258用于细胞固定后再染色，而hoechst33342则可以对活细胞直接进行染色!

　　染色步骤

　　PI(PropidiumIodide碘化丙啶)染色：是一种可对DNA染色的细胞核染色(PropidiumIodide，PI)是一种核酸染料(红试剂，常用于细胞凋亡检测。碘化丙啶色)，它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和坏死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。

　　用PI单一染色观测培养细胞，只能表示细胞的坏死情况，而不是凋亡(当然晚期凋亡PI亦可着色)。但是如果您只是想知道细胞的死亡情况，而不是仔细区分坏死或凋亡，那么PI单一染色也可以。但是如果您一定要认定细胞的凋亡，那么PI单一染色显然不够!

　　annexin-v染色细胞凋亡早期，细胞膜标志发生改变。其中，磷脂酰丝氨酸(Annexin-V，PS)外翻，Annexin-V在Ca2+存在的条件下与其高亲和力特异性结合。这样，Annexin-v染色阳性，表示细胞处于早期凋亡状态。Annexin-V结合不同的荧光抗体，就可以利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。AnnexinV用FITC标记发绿色荧光;如果用PE标记就发红色荧光。

　　JC-1染色JC-1是一种阳离子染料，可以在线粒体内聚集，低浓度时主要以单体(monomer)存在，发射光以绿光(～525nm)为主;而在高浓度时则可以形成多聚体(aggregation)，发射光以红光(-590nm)为主。线粒体本身存在一定的极性(polarization)，其外膜为负极，内膜为正极。电位差由Ca2+、Na+和H+流调控。当线粒体状态良好时对JC-l摄取量少，因而在线粒体内主要以单体的形式存在绿光强度/红光强度的比值较高。

　　在线粒体发生去极化(depolarization)时，线粒内JC-l的浓度较高，多以多聚体的形式存在，绿光强度/红光强度的比值降低。JC-1染色的绿光强度/红光强度仅取决于线粒体的膜电势(membranepotential)，而与线粒体的形态、体积和密度都无关，因而能更好地反映线粒体的功能状态。由于凋亡发生的早期存在线粒体的去极性，因此，JC-1染色被用于检测凋亡的早期发生。其实验方法如下。

　　JC-l染色非常简单。首先可将成品JC-1以DMSO配成储存液(1~5 mg/ml)，储存于-20℃，用时以培养液稀释至10 ug/ml 终浓度。对贴壁细胞可以直接弃去培养液，漂洗细胞后直接加入染色液，10~30 min后在荧光显微镜下或者激光共聚焦下观察。线粒体状态好时细胞以绿色为主，当红光信号增强时，红绿相叠，以橙色为主。该染色运用于悬浮细胞时还可以通过流式细胞仪进行检测，收集红/绿信号强度，计算其强度比。

　　钙黄绿素-AM(Calcein-AM)：Calcein-AM本身并不是荧光分子，但通过活细胞内的酯酶作用，Calcein-AM能脱去AM基，产生的Calcein能发出强绿色荧光(激发：490 nm，发射：515 nm)。因此Calcein-AM仅对活细胞染色。

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