荧光素标记抗体技术

[2013/9/18]

　　(一) 原理

　　目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocynate,FITC)或罗达明(Lis

　　samine rhodamine B200, RB200)。在硷性条件下 FITC 的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标

　　记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧

　　光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。

　　(二) 操作步骤

　　将纯化的 IgG 抗体对 PH9～9.5 碳酸盐缓冲液透析过夜，

　　透析后抗体液移入小烧杯中

　　↓

　　称取适量 IFTC，加入二甲亚砜(DMSO)(FITC～1mg/1ml DMSO) 使终浓度为 1mgFITC/1mlDMSO

　　FITC/IgG 比例:如 IgG 浓度为 1mg/ml，FITC/IgG 比例约为 50μgFITC/mgIgG;

　　如 IgG 为 5～10mg/ml，则比例为 25μgFITC/ml IgG 在 10ml 小烧杯中先放入抗体

　　↓

　　按上述比例将 FITC-DMSO 溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中

　　↓

　　将标记物用 PBS 加至 2.5ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌 2h ↓

　　用 PD10 柱(Sephadex G25 柱)除去游离荧光素，先用 25ml PBS 淋洗 G25 柱

　　↓

　　收集 PBS 洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定 F/P 比值。第二个荧光素峰为游离荧光素

　　计算:

　　2.87×A495

　　F/P=────────

　　A280-0.35×A495 合适的 F/P 值为 2～4。

　　(三) 试剂器材

　　1. 纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。

　　2. FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它荧光色素。

　　3. PBS、DMSO4. PH9～9.5 碳酸盐缓冲液: Na2CO34.3g，NaHCO3 8.6g 加蒸馏水至 500ml。

　　5. PD10 柱(Sephadex G25 柱)

　　6. 磁力搅拌器，紫外分光光度计等

　　(四) 注意事项

　　1. FITC 保存于 4℃暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解。

　　2. FITC-DMSO 液要临用时配制。

　　3. 碳酸盐缓冲液要新鲜配制。

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