DNA片断的回收

[2013/10/28]

　　DNA片断的回收

　　方法一：树脂回收技术

　　本方法特别适合于PCR片段的回收，具有纯度高、操作简洁等特点，经此方法回收的片段可有效的用于重组载体构建。通过15分钟的纯化过程,PCR产物即能被有效地从含引物二聚体、非特异性扩增引物片断等混合物中分离出来，成为高度无盐的、不含其他大分子成分的纯化片断。在较宽的分子量范围内有较高的回收效率。下表为不同长度的DNA片断,在室温条件下,用此纯化系统直接纯化时,各自相应的回收率。

　　dsDNA长度bp 200 1500 300 200 75 50

　　回收率% ≥ 60 96 99 69 3 2

　　一：仪器离心机电泳议电泳槽取液器微量真空装置抽滤装置

　　二：PCR片断纯化试剂盒80%异丙醇

　　三：操作

　　(一)从琼脂糖介质中纯化DNA片断

　　1:用低熔点或常规熔点琼脂糖电泳对PCR扩增片断进行分离,该电泳安常规方法进行,缓冲液为TAE.

　　2:在凝胶上,找到所需条带,然后用洁净并灭菌的小刀将其切下接近300微升琼脂糖凝胶 (约300毫克)

　　3:如果切下的琼脂糖为高融点的则安下面A步骤进行,如为低融点琼脂,则安B步骤进行。

　　A：将300微升琼脂块放进1.5毫升的微量离心管中,加入1毫升纯化用树脂,然后将其置于65℃水浴保温5分钟,或保温至琼脂完全溶解。

　　B：将300微升琼脂块放进1.5毫升的微量离心管中,然后将其置于70℃水浴保温至琼脂完全溶解,然后加入1毫升纯化用树脂到融化好的琼脂中,将其混合20秒,但不要振动。

　　4:为每一个待回收片断准备好一个微量柱. 在每个柱的开口处,联上一针筒,然后将这些柱与针筒的复合体与抽真空设备相连

　　5:在柱-针筒复合体中加入树脂/DNA混合物,打开真空装置,将树脂与DNA的混合物抽到微量柱中,断开真空装置与柱的连接。

　　6:洗柱,加入2毫升80%的异丙醇,打开真空装置,使这些洗柱液完全流经微量柱。

　　7:继续真空30秒以干燥树脂,注意此干燥时间不能超过30秒。关闭真空,移去针筒。将微量柱转移至一1.5毫升微量离心管中。10000g离心2分钟,以彻底除去残存的异丙醇。

　　8: 将微量柱,再转移至一新的1.5毫升微量离心管中,加入50微升水或TE缓冲液,静置1分钟(在头30秒,DNA仍将吸附于柱上), 10000g离心20秒,以洗脱DNA片断，所得纯化后的DNA片断可直接用于连接反应或在-20℃保存。

　　注：1对于>3Kb的片断在纯化回收时,洗脱前,如先将水或TE缓冲液预热到65-80℃,则将能有效的提高回收率。待洗脱片断>3Kb时,洗脱液温度应为65-80℃;待洗脱片断>20Kb时,洗脱液温度应达80℃。

　　2应用TAE缓冲液，而不应用含TBE的胶，因硼酸能与琼脂糖中的方式糖单体或多聚体结合成难溶复合物，这种复合物使胶难熔解。

　　3：在取用纯化柱树脂中的液体前,应将树脂充分搅匀,如树脂中出现结晶或结块,则应将树脂在25-37℃,温热10分钟,冷却至30℃使用。树脂本身不会溶。

　　4：在紫外光下观察切割条带时,操作要快，DNA条带在紫外光下的暴露时间应尽量短，因UV会引起DNA变异。

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