维生素D的测定方法

[2013/11/20]

  高效液相色谱法

  1. 原理

  样品中脂溶性维生素在皂化过程中与脂肪分离,以石油醚萃取后,用正相色谱柱提取富集,用反相色谱柱,紫外检测器定量测定。

  2. 适用范围

  本方法来源于GB/T 5413.9-1997。适用于婴幼儿配方食品和乳粉维生素A、维生素D、维生素E的测定;也适用于食品或强经食品及饲料中的维生素D含量的测定。

  3. 主要仪器

  1) 高压液相色谱仪,具有可变波长的紫外检测器,数据处理系统或记录仪。

  2) 旋转蒸发器。

  3) 平底烧瓶:250mL。

  4) 分液漏斗:500mL。

  4. 试剂

  所有试剂,如未注明规格,均指分析纯,所实验用水均指蒸馏水。

  1) 异丙醇:色谱纯。

  2) 2%焦性没食子酸乙醇溶液:取2g焦性没食子酸溶液于100mL无水乙醇中。

  3) 75%氢氧化钾溶液:取75g氢氧化钾溶于100mL水中。

  4) 石油醚:沸程30~60℃。

  5) 甲醇:色谱纯。

  6) 正己烷:色谱纯。

  7) 环己烷:色谱醇。

  8) 维生素D标准溶液

  A. 维生素D2标准贮备液:含维生素D2100mg/ml的甲醇溶液。称取10mg的维生素D2,用甲醇定容于100mL容量瓶中。

  B. 维生素D3的标准贮备液:含维生素D3100mg/ml的甲醇溶液。称取10mg的维生素D3,用甲醇定容于100mL容量瓶中。

  5. 操作步骤

  5.1样品处理:准确称取10g样品,于250mL平底烧瓶中,加30mL蒸馏水。

  5.2测定液的制备:

  1) 于上述样品溶液中加入100mL的20%没食子酸乙醇溶液,充分混匀后加50mL75%氢氧化钾溶液,在蒸汽浴上边续回流30min后,立刻冷却到室温。

  2) 将皂化液转入一500mL分液漏斗中,用100mL水分几次冲平底烧瓶。洗涤液并入分液漏斗中。

  3) 于上述分液漏斗中,加入100mL石油醚,盖好瓶塞,倒置分液漏斗并剧烈振摇1 min.在振摇过程中,注意释放瓶内压力。静置分层,将水相放入另一500mL分液漏斗中,重复上棕萃取过程2次,合并醚液到第一个分液漏斗中。用蒸馏水洗该醚液至中性,通过无水硫酸钠过滤干燥,在40℃和氮气流下,于旋转蒸发器上蒸至近于(绝不允许蒸干)后,用石油醚转移至10mL容量瓶中,定容。

  4) 从上述容量瓶中取7mL放入一试管中,用氮气将石油醚吹干,于试管中加1mL正己烷。

  5.3测定:

  1) 测定液的制备:

  A) 仪器条件:

  色谱柱:30cm×40cm,硅胶柱。

  流动相:正己烷与环己烷按体积比1:1混合,并按体积分数0.8%加入异丙醇。

  流速:1mL/min。

  波长:265nm。

  柱温:20℃。

  灵敏度:0.005AU/MV。

  注射体积:200mL。

  B) 注射50mL维生素D标样和200mL样品溶液,根据维生素D标样保留时间收集维生素D于试管中,将试管用氮气吹干,准确加入0.2mL甲醇溶解。

  2) 测定步骤:

  A) 仪器条件:

  色谱柱:4.6mm×25cm,C18或具同等性能的色谱柱。

  流动相:甲醇。

  流速:1mL/min。

  波长:265nm。

  柱温:20℃。

  灵敏度:0.005AU/MV。

  注射体积:50mL。

  B) 注射50mL维生素D标准溶液,注射50mL样品溶液,得到标样和样品溶液中维生素D峰面积或峰高。

  6. 计算

  ρs×10∕7×40×100

  X =

  m

  As

  ρs= ---×ρsd

  Asd

  式中: X--样品维生素D的量,mg/100g;

  m--称样量,含量,IU∕100g;

  ρs --进样液中维生素D有浓度,mg/mL;

  A s --进样液中维生素D有峰高(或峰面积);

  A s d --标样液中维生素D有峰高(或峰面积);

  ρsd --标样中维生素D的浓度;

  计算结果精确至小数点后一位。

  7. 注意事项

  1) 允许误差及最小检出量:同一样品的2次测定值之差不得超过2次测定平均值的10%;最小检出量为0.1国标单位。

  2) 试剂焦性没食子酸容易变性,应购习近期生产的试剂。

  3) 如果皂化不完全,可适当增加氢氧化钾的加入量。