质粒DNA的分离、纯化

[2013/12/27]

　　所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增;收集和裂解细菌;分离和纯化质粒DNA。

　　1、碱裂解法原理:本实验采用碱裂解法进行质粒的小量制备。十二烷基磺酸钠( SDS SDS)是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。

　　用SDS 处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA 和染色体 DNA 。两种 DNA 在强碱环境都会变性。

　　当加入 pH4.8 的酸性乙酸钾降低溶液 pH 值后，质粒 DNA 将迅速复性，而染色体 DNA 分子巨大，难以复性。

　　通过离心，大部分细胞碎片、染色体 DNA 、RNA 及蛋白质沉淀( SDS 的作用下 )除去，而质粒 DNA 留在上清中。

　　再用异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒 DNA 。

　　2、实验材料、主要仪器和试剂

　　(1)材料：含有质粒PBLG的大肠杆菌DH5α

　　(2)仪器：塑料离心管架(30孔);10、100、1000μL微量加样器;1.5mL塑料离心管(又称EPPendorf离心管);低温高速离心机(20 000 r/min)一台;无菌工作台;高压锅;常用玻璃仪器及滴管等。

　　(3)试剂：LB培养基成分如下：每升含有胰蛋白陈10g，酵母提取物5g，NaCI10g，琼脂糖或琼脂(固体培养基时用)15g，用NaOH调pH至7.0;pH8.0 GET缓冲液(50mmol葡萄糖，10mmol/L EDTA，25 mmol/L Tris-HCl);0.2mol/L NaOH(内含1%的SDS)，注：临用时配;pH4.8乙酸钾溶液(60mL 5mol/L KAc，11.5mL冰醋酸，28.5mL H2O)：该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L;异丙醇;70%乙醇;pH8.0 TE缓冲液：10 mmol/LTris-HCI，lmmol/L EDTA，其中含RNA酶20ug/mL。

　　3、操作步骤

　　1)培养细菌将大肠杆菌PBLG接种在LB固体培养基上，37℃培养12h，挑一个菌斑接种在液体LB培养基上，37℃培养12～16h。

　　2)从菌落中快速提取制备质粒DNA

　　(1)在无菌工作台上取1.5mL菌液加入EPPendorf离心管中，转速10000r/min，离心lmin，去掉上清液(注意，一定要吸干上清液)。加入150μlGET缓冲液，充分混匀，在室温下放置10min。

　　注：溶菌酶在碱性条件下不稳定，必须在使用时新配制溶液。使用EDTA是为了去除细胞壁上的Ca2+，使溶菌酶更易与细胞壁接触。

　　(2)加入200μl新配制的0.2mol/LNaOH(内含1%SDS)。加盖，颠倒2～3次，使之混匀，冰上放置5min。

　　注：SDS能使细胞膜裂解，并使蛋白质变性。

　　(3)加入150μl冰冷的乙酸钾溶液(pH4.8)。加盖后颠倒数次使混匀，冰上放置3-5min。

　　(4)用低温高速离心机，转速为10000r/min，离心5min，上清液倒入另一干净的离心管中。

　　注：乙酸钾能沉淀SDS和SDS与蛋白质的复合物，在冰上放置5min是为了沉淀完全。如果上清液经离心后仍混浊，应混匀后再冷却至0℃重新离心。

　　(5)另取一个Eppendorf管，转入上清，并加等体积异丙醇，混匀，室温放置5min，12000r/min离心5min，弃去上清液。

　　(6)加入200μl无菌蒸馏水溶解沉淀，再加入1/2体积7.5mol/L NH4Ac，混匀后冰浴3～5min，以12000r/min离心5min。

　　(7)转移上清至新管中，并加入等体积异丙醇或2倍体积无水乙醇，室温放置5min后以12000r/min离心30min。弃去上清。

　　(8)沉淀用70%乙醇洗涤一次，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥。

　　(9)加入20μlTE，使DNA充分溶解，置-20℃贮存,待用。

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