细菌中提取分泌蛋白质的方法

[2014/1/2]

　　客户需要从细菌中提取一种可分泌至培养基上清的一种小分子多肽，按照文献的方法是取细菌上清后用氯仿抽提，可反复做过多次，蛋白总是没有活性，不知道各位同仁有没有什么好方法?请指教!

　　以下参考意见：

　　参考一：

　　氯仿是有机溶剂，所以但没有活性。分离这种分泌性蛋白质，可以先将上清液透析，然后过柱。

　　参考二：

　　蛋白要保持活性，必须维持三维构象，而在有机溶剂处理的情况下，蛋白的三维构象被破坏，自然就没有活性了。

　　如果你的培养液是高盐浓度的，你可以在得到上清的可溶性蛋白后，加入5-10倍体积的复性液，以稀释盐浓度，防止在下一步透析过程中随着盐浓度的降低，造成蛋白析出沉淀而丧失活性，然后用透析袋进行透析，4度以防止蛋白降解，4-6小时，然后冷冻干燥，这样得到的蛋白就能保持活性了。

　　参考三：

　　你的蛋白链内有二硫键么?结构一般不会太复杂吧?除非有复杂的二硫键，这么小的蛋白，复性应该不是主要矛盾。

　　一些小蛋白如果在有机溶剂中发生的疏水结构的改变是可逆的，而且疏水性较强，那可能就可以用氯仿抽提，很容易和大部分蛋白分开，不过脂类和脂蛋白肯定去不掉。

　　但是能溶于氯仿，你的蛋白我怀疑很有可能一般的水相条件并不是很好溶，先确定一下这个问题，然后结合你的测活方法，看看是不是在测活的时候蛋白失活的。

　　参考四：

　　我的蛋白确实是在一般的水相条件不好溶，活性的检测方法没什么问题，

　　氯仿抽提后用6M的尿素溶解，加ddH2O 倍比稀释后检测活性! 这是文献上的方法，可总是没有活性。不知道是不是氯仿抽提的方法有问题? 氯仿抽提法有没有什么要注意的地方?

　　参考五：

　　培养上清中没有尿素，可能蛋白浓度不高，但还是要确定一下蛋白能溶么?

　　或是直接纯化前取上清测活看看，到底是不是氯仿的问题。

　　参考六：

　　我所提的蛋白是不溶于水的，但是在6M、8M的尿素中是可容的

　　取上清做证实上清是有活性的，所以我觉得是尿素没有将我所需求的蛋白抽提出来，不知道是不是细节上出了些问题?各位，有没有更好的办法呢?

　　参考七：

　　是氯仿没有把我所需的蛋白抽提出来

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