如何解决色谱柱使用过程中出现的问题

[2014/8/7]

  一、保留值与分离度重现性不好原因分析

问题

原因

表现

不同色谱柱间差异使用期间柱变化

填料、键合相不同

柱床破坏

键合相丢失

硅胶基质溶解

强保留组分堆积堵塞

保留因子(k), 分离因子(a

柱效(N

保留因子(k), 分离因子(a

柱效(N)

保留因子(k), 柱效(N)

柱外效应

系统差异、进样量大、进样阀与色谱柱之间、色谱柱与检测器之间的管路太长、检测器流通池体积大、接头死体积大等。

柱效(N)

分离效果变差

流动相组分改变

流速改变

温度改变

保留因子(k),柱效变化很小

保留因子(k), 分离因子(a)

保留因子(k), 柱效变化很小

柱平衡慢

重新平衡时间不够

保留因子(k), 柱效变化很小

柱超载

样品量太大

保留因子(k), 柱效(N)


  二、造成色谱峰( 不对称)拖尾的原因

  1.色谱柱本身填装问题,筛板堵塞或填料塌陷;

  2.柱头有污染;

  3.样品超载;

  4.样品溶剂不合适;

  5.柱外效应;

  6.化学或二次保留(硅羟基)效应;

  7. 缓冲容量不足或不合适;

  8. 重金属污染。

  三、如何解决峰形拖尾的问题

  A. 与化学有关的拖尾问题

  1.流动相中,加入30mM的三乙胺(用于碱性化合物)或醋酸胺(用于酸性化合物), 未知化合物加醋酸三乙胺;

  2.如仍然拖尾,将三乙胺换为二甲基辛胺(或醋酸二甲基辛胺);

  3.降低进样量至<1μg。

  B. 与色谱柱有关的拖尾问题

  1.如柱头处有强保留的样品组分积聚,反相柱可用20倍柱体积的96%的二氯甲烷与4%甲醇,加1%氢氧化铵混合液冲洗;正向柱可用甲醇冲洗;

  2.使用保护柱。

  C. 与HPLC系统有关的峰拖尾和峰加宽

  1.进样体积过大,(通常≤25μL);

  2.进样阀与色谱柱及检测器之间的管路体积过大(最佳连接管应<20cm,内径为0.007");

  3.检测器流通池的体积过大。

  四、如何贮存色谱柱

  1.防止缓冲溶液和水溶液流动相产生微生物,做到流动相用多少配多少, 或在水流动相中加200ppm的叠氮钠以抑制细菌生长(一定当心其毒性和潜在的爆炸性);或在流动相中加20%的有机改性剂,也可抑制微生物生长, 有机改性剂还有助于流动相脱气。

  2.尽可能将色谱柱贮存于100%有机溶剂(乙晴最好)中,避免在缓冲溶液中保存。

  3.使用缓冲溶液后的色谱柱,应用15~20倍柱体积的不含缓冲剂的同种水-有机溶剂流动相冲洗色谱柱,后换成100%有机溶剂贮存。

  4.避免用纯水冲洗键合致密的C18柱。

  5.将色谱柱的两端用堵头拧好,以免柱床填料干裂。