PCR扩增产物鉴定与纯化实验原理及实验过程

[2015/3/24]

实验原理

琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物。（原理参照琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验）

 

本实验使用了TaKaRa公司的胶纯化试剂盒（Agarose Gel DNA Purification Kit），该试剂盒是从琼脂糖凝胶中回收并纯化DNA片段的试剂盒。试剂盒采用了独特的凝胶融解系统，结合DNA制备膜技术，具有高效、快速、方便的特点，全套操作只需30min便可完成。使用该试剂盒每次可纯化得到多至10µg的DNA片段（100bp～30kb），回收率高达50～80%。本试剂盒回收纯化的DNA片段纯度高，完整性好，可直接用于连接反应、PCR扩增、DNA测序等各种分子生物学实验。

 

经胶纯化试剂盒回收的DNA片段采用-20℃低温保存，延缓DNA的降解。

 

实验试剂

1. PCR扩增产物

2. Agarose Gel DNA Purification Kit (TaKaRa)

3. 琼脂糖

4. 1×TAE

5. 6×Loading Buffer

6. DNA Marker 2000

 

实验设备

1. 琼脂糖凝胶电泳系统

2. 紫外透射仪

3. 台式离心机

4. 移液枪（配套枪头）

5. -20℃低温冰箱

6. 分析天平

 

实验材料

1. 单面刀片

2. 纯化试剂盒

3. 1.5mL离心管

4. 超纯水（无菌）

 

实验步骤

1. 使用1×TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。（参照琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验）

2. 在紫外灯下切出含有目的DNA（约600bp）的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。

     注意：切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。

3. 切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块融化时间，提高DNA的回收率。

4. 称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg=1µL进行计算。

5. 向胶块中加入胶块融化液DR-I Buffer，DR-I Buffer的加量如下表：

 

凝胶浓度     DR-I Buffer 使用量  

1%                 3个凝胶体积量 

1%-1.5%       4个凝胶体积量 

1.5%-2%       5个凝胶体积量

 

6. 均匀混合后75℃加热，融化胶块（低熔点琼脂糖凝胶只需在45℃加热）。此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约6～10分钟）。

注意：胶块一定要充分融化，否则将会严重影响DNA的回收率。

7. 向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer量的1/2体积量的DR-II Buffer，均匀混合。当分离小于400 bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。

8. 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。

9. 将上述操作7的溶液转移至Spin Column中，12000 rpm离心1min，弃滤液。

注意：如将滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率。

10. 将500 µL的Rinse A加入Spin Column中，12000 rpm离心30s，弃滤液。

11. 将700 µL的Rinse B加入Spin Column中，12000 rpm离心30s，弃滤液。

12. 重复操作步骤11。

13. 将Spin Column安置于新的1.5 mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入25 µL的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1min。

注意：使用加热至60℃的灭菌蒸馏水或Elution Buffer有利于提高洗脱效率。

14. 12000 rpm离心1min洗脱DNA。

-20℃低温保存纯化的目的DNA片段。

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