免疫胶体金的操作程序和优点

[2015/8/15]

免疫胶体金-银染色(immunogold-sliverstaining)技术系20世纪80年代Holgate将免疫金染色和银显影方法结合而建立的一种新型检测技术,亦可用于电镜包埋前染色。其基本原理是先进行免疫胶体金染色标记抗原,使其结合在组织细胞抗原所在位置,然后进行物理显影,当显影剂中的对苯二酚将银离子还原成银原子时,后者将围绕金颗粒形成一个“银壳"。“银壳"本身亦具有催化作用,进一步促使更多银离子还原,则使“银壳"越来越大,抗原位置因此而变得清晰,抗原信号也得以放大,故此法是最为敏感的细胞化学方法之一。因金颗粒的电子密度高,加之敏感性也高,故特别适合免疫电镜的抗原研究。

主要操作程序如下:
1.组织固定后,5%10%20%系列浓度的蔗糖处理,制作冰冻切片,厚1030gm
2.1%正常羊血清或1%BSAPBS室温孵育20分钟,封闭抗体非特异性结合部位;
3.1%氢硼化钠的PBS孵育20分钟;
4.第一抗体孵育,可先置4℃,1218小时,然后室温1小时,使抗体充分渗透并结合;
5.PBS漂洗3次,每次5分钟;
6.0.1% BSA/PBS(pH 8.2)漂洗5分钟,为胶体金结合提供碱性环境;
7.胶体金标记的第二抗体(pH 8.2)室温孵育3045分钟,需摸索最佳稀释度;
8.硝酸银液避光处理210分钟,显影时间最好根据实验结果确定;
硝酸银液配制:双蒸水60ml,枸橼酸缓冲液10ml,对苯二酚1.0g溶于30ml双蒸水,将三者混合,完全溶解后,用前入硝酸银液2.0ml(35mg硝酸银)混匀;
枸橼酸缓冲液的配制:枸橼酸(C6 H8O-7H2 O)25. 5g,枸橼酸三钠(NaC6H5O7 2H2 0)23.5g,用双蒸水溶解至100ml,即为pH 3.5的枸橼酸缓冲液。
9.解剖显微镜下选取免疫反应阳性部位。1%OsO4后固定30分钟,双蒸水漂洗;
10.组织标本的脱水、树脂包埋、超薄切片制作及电镜观察等方法同前述。

主要优点:该方法形成的金银颗粒电子密度高,反差强,敏感度高;包埋前染色的标本可在解剖显微镜下选取阳性部位,结合半超薄切片的应用,能明显提高工作效率,特别适于抗原含量少的组织细胞的免疫电镜研究。缺点:显影处理需在暗室进行,操作较繁琐;而且增加包埋前免疫染色处理的步骤易导致非特异性着色;另外,单个金颗粒周围结合的银粒子不甚牢固,漂洗等处理容易脱离,半定量研究时应注意;此外银等废液直接流人下水道,容易导致环境污染。