Southern转印分析方法步骤

[2015/9/11]

在胶体中的DNA可利用毛细现象的作用将DNA牵引转印至覆盖在胶片上的滤膜，经烘烤或UV照射后，可使DNA固定在膜上，以进行探针的杂合（hybridization）反应。

仪器用具：
玻璃缸；玻璃板或吸水海绵；Crosslinker

药品试剂：
10×SSC（1.5MNaCl；0.15Msodium citrate）或20×SSC
变性溶液（1.5M NaCl；0.5 NNaOH）
中和溶液（1MTris-Cl；1.5 M NaCl，pH7.5）
Nylon membrane尼龙膜
40 Methods in Biotechnology Vol 1
Whatman 3MM滤纸
吸水纸

方法步骤：
1）电泳的洋菜胶片，浸于0.25NHCl中15min（当DNA分子量不大时，可省去此步骤）；以无菌水润洗胶片后，将胶片置于变性溶液中，于室温缓慢震荡15min，更换新的变性溶液后再处理15min.
2）以无菌水润洗胶片，再以中和溶液浸泡30min，其间更换一次。
3）戴手套将尼龙膜剪裁成胶体大小，在角落剪一缺口作记号。另裁剪数张较胶片稍小的3MM 滤纸。
4）取一玻璃缸，加入10×SSC。将一块长形玻璃板架在缸上，裁剪一张长形3MM滤纸，宽度须略大于胶片，将滤纸置于玻璃板上，使滤纸两端顺着玻璃板垂入缸内溶液中。加一些10×SSC于滤纸上使其湿透，并赶掉滤纸与玻璃板间的气泡。
若有3~5cm厚的干净海绵，则可取代玻璃板。可将海绵置于缸中，加入10×SSC，但不可淹过海绵。海绵湿透后，其上放一张比胶片大的3MM滤纸，要赶掉滤纸与海绵间的气泡。
5）将处理过的胶片置于滤纸上，赶掉气泡，小心将尼龙膜盖在胶片上，不要有气泡产生。再依序盖上两张以10×SSC浸湿的滤纸及两张干的滤纸，并以保鲜膜将胶片四周封住。最后覆盖一迭吸水纸，上面放一块玻璃板或塑料板，以重物压住即可。在室温下静置过个夜。
6）转印后，小心移去重物、吸水纸、3MM 滤纸等，在尼龙膜相对于样品槽的位置作记号。将尼龙膜掀开，与胶片接触面朝上，置于10×SSC中缓慢震荡5min，以洗去附着在膜上的洋菜胶。转印后的胶片可再以EtBr染色，视是否转印完全。
7）将尼龙膜置于干净的滤纸上（与胶片接触面朝上），移至UVcrosslinker中，进行crosslinking 以将DNA固定在膜上。
8）干燥后的尼龙膜即可进行杂合。若不立即进行杂合，可将尼龙膜夹于两张滤纸间，置于干燥箱中存放。

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