典型PCR操作程序与优化方法

[2015/9/14]

一、试剂
（1）引物根据待扩增DNA不同，引物亦不同。
（2）耐热DNA聚合酶：此酶是从耐热细菌中分离出来的，能耐受高温（93~100℃）。
（3）10x PCR缓冲液：500mm01／LKCl； 100mmol／LTris-HCl（pH8.4，20c），150mmol／LMgCl2，lmg／m1明胶。
（4）5mmo1／LdNTP贮备液：将dATP，dCTP，dGTPT和dTTP钠盐各100mg合并，加3m1灭菌去离子水溶解，用NaOH调pH至中性，分装每份300v1，-20℃保存，dNTP浓度最好用uv吸收法精确测定。
（5）标本处理试剂：不同标本所需试剂不同，根据具体情况而定。

二、操作程序
利用PCR扩增的操作程序基本相同，只是根据引物与靶序列的不同，选择不同的反应体系与循环参数，基本的操作是将PCR必需反应成分加入一微量离心管中，然后置于一定的循环参数条件下进行循环扩增。每个实验室或每个人都有不同的操作习惯，但需遵守一定的操作规范。推荐下述操作程序，因这样操作可最大程度地增加反应的成功率。
（1）向一微量离心管中依次加入：
ddH2O补至终体积（终体积50~100ul）
10xPCR缓冲液1／10体积
dNTP各200umol／L
引物各1umol／L
DNA模板
混匀后，离心15s使反应成分集于管底。
（2）加石蜡油50~100ul于反应液表面以防蒸发。置反应管于97c变性7min（染色体DNA）或5min（质粒DNA）。
（3）冷至延伸温度时，加入1~5UTaqDNA聚合酶，在此温度作用1min。
（4）于变性温度下使模板DNA变性适当时间。
（5）在复性温度下使引物与模板杂交一定时间。
（6）在延伸温度下使复性的引物延伸合适的时间。
（7）重复（4）~（6）步25~30次。每次即为一个PCR循环。
（8）微量琼脂德凝胶电泳检查扩增产物。

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