柱离心法纯化质粒DNA

[2015/9/21]

实验原理：
1.离心柱结构：特殊硅基质吸附材料，特异性吸附DNA，而RNA与蛋白质穿过。在正常情况下，核酸表面覆盖了一层由水分子组成的亲水薄膜，以维持其水溶性。高浓度盐离子的加入破坏了核酸表面亲水薄膜的相对有序排列，形成了疏水环境。在此环境中，核酸与硅胶膜能有效结合，而蛋白质、代谢产物和其他污染物则不能结合。
2.碱变性抽提的原理是在pH高于12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，破坏了碱基配对，导致双螺旋结构解开而变性，但闭环的质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当pH调至中性时，质粒DNA链迅速恢复到原来构型，仍保存于溶液中。而变性的染色体DNA不能再复性，通过离心，随不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，使两者得以分离。

实验试剂：
1.试剂盒自带溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ
2.漂洗液
3.结合缓冲液
4.洗脱缓冲液
5.TE buffer

实验设备：
1. 吸附柱
2. 取液枪
3. 离心机
4. 低压电泳仪
5. 水平电泳槽
6. 紫外透射仪

实验材料：带有质粒的大肠杆菌

实验步骤：
1.培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5~3ml含有相应抗生素的液体培养基，37℃培养12～16小时；
2.取液体培养液3ml(1.5mlX2)于离心管中，10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100ml 溶液I，充分混匀；置冰上；
3.加入150ml溶液II，加盖颠倒6~7次使之混匀，冰上放置1~2min；
4.加入150ml溶液III，加盖后颠倒6~7次混匀，冰上放置5min；
5.用台式高速离心机，12000r/min离心10min；
6.吸附柱中加入420ul结合缓冲液，将步骤5中的上清转移至吸附柱中，盖上收集管的盖子，混匀，12000r/min离心1min；
7.取下吸附柱，倒掉收集管中的液体，吸附柱放回同一收集管，向吸附柱中加入600ul漂洗液，静置1min，12000r/min离心30s；
8.重复步骤7一次；
9.取下吸附柱，倒掉收集管中的液体，吸附柱放回同一收集管，12000r/min离心2min；
10.吸附柱放入一个新的1.5ml离心管，在吸附柱的中央加40ul洗脱缓冲液或TE buffer，室温放置3~5分钟。盖好盖子12000rpm离心1分钟，收集质粒DNA溶液。
11.取5ul电泳检查，（100ml凝胶加入5ul染料）。

注意事项：加样时要排出枪头中的空气，以免搅动液面。

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