如何提取总RNA?

[2015/11/17]

如何提取总RNA,完整RNA的提取和纯化,是进行RNA方面的研究工作,如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCRcDNA合成及体外翻译等的前提。所有RNA的提取过程中都有五个关键点,即1):样品细胞或组织的有效破碎;2),有效地使核蛋白复合体变性;3),对内源RNA酶的有效抑制;4)有效地将RNADNA和蛋白混合物中分离;5对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径,1,提取总核酸,再用氯化锂将RNA沉淀出来;2,直接在酸性条件下抽提,酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失,目前该方法的使用频率已很低。

如何提取总RNA,方法一RNA的试剂盒快速提取
一些公司推出的总RNA提取试剂盒,可以用来制备高质量的可用于建库的RNA。该总RNA纯化系统采用两种著名的RNA酶抑制剂,异硫氰酸弧GTC和β-巯基乙醇,加上整个操作都在冰浴下进行,这样就能显著降低RNA的降解速率。GTCN-十二烷基肌氨酸钠的联合使用,将促使核蛋白复合体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。而进一步从复合体中纯化RNA,则根据Chomc zynskiSacchi的一步快速抽提法进行,采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚将使RNA进入水相,这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。水相中的RNA可用异丙醇沉淀浓缩。进一步将上述RNA沉淀复溶于GTC溶液中,接着用异丙醇进行二次沉淀,随后用乙醇洗涤沉淀,即可去除所有残留的蛋白质和无机盐,而RNA中如含无机盐,则有可能对以后操作中的一些酶促反应产生抑制。

一:仪器恒温水浴,冷冻高速离心机,紫外分光光度计,取液器,电泳仪,电泳槽。

二:试剂RNA提取试剂盒,0.05%焦碳酸二乙酯DEPC75%乙醇

三:操作步骤
):细胞或组织破碎
A微生物材料
1:发酵3~4或对数生长期的菌体,离心收集菌丝体动植物材料无需此步处理)。
2:用经DEPC处理的水洗菌丝体2~3次,并尽量除去残存的水
3:加液氮充分研磨,使其成为粉末,以释放RNA
4:研磨后的样品转移至12ml变性液的容器中匀浆。

B动植物细胞培养材料适用的样品量为细胞108)。
1细胞或组织培养按常规方法进行
2深层悬浮培养细胞的破碎
1细胞收集含一定浓度的细胞培养液置于无菌离心管中,4℃,3000g离心5分钟
2细胞洗涤上步沉淀用25毫升灭菌后冰冻的1×PBS缓冲液洗涤,然后4℃,3000g离心5分钟
3细胞破碎在沉淀细胞中加入15毫升预冷的变性液,用无菌处理过的匀浆器匀浆
3表面培养细胞的破碎
1确定培养瓶数量,使选定的各培养瓶细胞累加后总量达108
2细胞收集将培养液倒掉,用预冷的无菌PBS缓冲液洗涤一次,在培养瓶中加入8毫升预冷变性液,转动培养瓶,使细胞溶解,此时可见粘度加大。
3用无菌吸管将第一个培养瓶中的液体吸入第二个培养瓶,旋转,溶解细胞,再吸入第三个培养瓶,以此类推,直到将所选定的培养瓶全部洗涤一次,然后从第一个培养瓶开始再加入4毫升上述变性液,将所有培养瓶洗一次。
4将上述12毫升含细胞的变性液转移至一50毫升无菌离心管中,匀浆破碎细胞。

C植物组织破碎适用的样品量为0.05g组织)。
1600ul变性液置于1.5ml离心管中,将此离心管放于冰浴中5分钟。
20.05g新鲜组织用液氮冰冻
3在液氮下,研磨组织块
4待液氮挥发后,将上述分散的组织转移至无菌离心管中。

D动物组织破碎适用的样品量为1克组织
112毫升变性液置于50毫升离心管中,将此离心管放于冰浴中5分钟。
2在上述管中加入1克新鲜或冰冻动物组织,匀浆粉碎。

1研磨组织块用于RNA提取的样品,必须是新鲜的细胞或组织,如采样后,不能立即用于提取则样品应用液氮速冻并贮于-70℃的冰箱中保存。
2变性液及相应的离心管需预冷。

):RNA的抽提
在经变性液匀浆的细胞或组织600ul60ulpH4.02M乙酸钠彻底混匀,可用漩涡振荡器。
600ul\氯仿\异戊醇25\24\1,彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒。
冰裕中10~15分钟,离心,4℃,10000g20分钟。
上层水相吸至无菌离心管中+等体积的异丙醇,-70℃,30分钟沉淀RNA
离心4℃,10000g20分钟。
沉淀RNA,冷冻干燥15分钟,RNA沉淀重新溶于300ul变性液中,可振荡有时为了帮助溶解,可在65℃加热,但时间应极短
60ulpH4.02M乙酸钠彻底混匀,可用漩涡振荡器。
600ul\氯仿\异戊醇25\24\1,彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒。
冰浴中10~15分钟,离心,4℃,10000g20分钟。
上层水相吸至无菌离心管中。
等体积异丙醇二次沉淀-70℃,30分钟75%乙醇洗沉淀,沉淀冷冻干燥,复溶于去RNA酶的水中对于准备长期保存的RNA可加入pH 5.0的乙酸钠至终浓度为0.25M,再加入2.5体积的乙醇,~70℃保存。

注:1变性液组成:25g异硫氰酸胍溶于33mlCSB42mM pH4.0乙酸钠、0.83%十二烷基肌氨酸钠、0.2mM β-巯基乙醇65℃溶解,过滤灭菌,4℃预冷。
2酸性酚配制:55℃时,500g酚溶入500ml50mMpH4.0乙酸钠,混匀,静止分层后,去上清,再反复加500ml50mMpH4.0乙酸钠,直到pH<4.1