基因转染实验（脂质体介导DNA转染法）

[2015/12/17]

　　脂质体（lipofectin regeant，LR）试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy，Propyl]-n，n，n-Trimethylammonium Chloride（DOTMA）和Dioleoyl photidye-thanolamine（DOPE）的混合物[1：1（w/w）]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。

　　用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间（2~24小时）。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。

　　细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。

　　1、操作步骤[方法一]：
　　（1）细胞培养：取6孔培养板（或用35mm培养皿），向每孔中加入2mL含1~2×105个细胞培养液，37℃CO2培养至40%~60%汇合时（汇合过分，转染后不利筛选细胞）。
　　（2）转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液（为转染每一个孔细胞所用的量）A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释2-50μgLR，终量100μL，轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染（如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量）。
　　（3）转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。
　　（4）转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃温箱置6~24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。
　　（5）其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。
　　注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。

　　2、快速脂质体转染法操作步骤如下[方法二]：
　　（1）以5×105细胞/孔接种6孔板（或35mm培养皿）培养24小时，使其达到50~60%板底面积。
　　（2）在试管中配制DNA/脂质体复合物方法如下：
　　①在1mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo质粒DNA或供体DNA。
　　②旋转1秒钟，再加入脂质体悬液，旋转。
　　③室温下放置5~10分钟，使DNA结合在脂质体上。
　　（3）弃去细胞中的旧液，用1mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂质体复合物，37℃培养3~5小时。
　　（4）再于每孔中加入20%FCS的DMEM，继续培养14~24小时，
　　（5）吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培养24~48小时。
　　（6）用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。

　　3、稳定的脂质体转染方法如下：
　　（1）接种细胞同前，细胞长至50%板底面积可用于转染。
　　（2）DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前（2）、（3）步骤。
　　（3）在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM，37℃培养48小时。
　　（4）吸出DMEM，用G418选择培养液稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染克隆方法参照细胞克隆筛选法进行。

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