基因组DNA提取纯化的注意事项

[2015/12/23]

　　组织样本DNA纯化
　　大多数动物组织可以用裂解缓冲液和蛋白酶/蛋白酶K进行高效裂解。在加入裂解液之前需要将组织切成小块，有条件的话建议使用TissueLyser或研钵等提前进行均质化。骨骼肌，心脏，皮肤等组织含有收缩蛋白，结缔组织和胶原蛋白，所以利用蛋白酶/蛋白酶K进行充分消化是必须的。
　　FFPE样本进行DNA纯化时需要预裂解。福尔马林可由PBS洗涤除去，石蜡可由二甲苯和乙醇进行去除。在蛋白酶消化后提高孵育的温度有助于逆转交联，以便更好的从FFPE组织中释放DNA，从而有助于提高DNA产量和改善下游检测性能。从FFPE中得到的DNA通常比从新鲜或冻存样本中得到的DNA分子量小；DNA降解的程度则取决于样本类型，储存时间和固定的条件。

　　从微量样本中纯化DNA
　　微量样本中DNA的含量很低，通常小于5ngDNA，通常需要使用carrier RNA来提高产量（不会影响下游分析检测）。如果需要使用carrier RNA，那么在测量OD的时候会因为使用carrier RNA造成浓度测量有偏差（因为RNA在260nm也有吸收）。
　　推荐使用QIAamp DNA Micro Kit从微量样本中进行DNA纯化，该试剂盒采用 MinElute硅胶膜柱，洗脱体积可以低至20μl，同时通过两步洗涤去除PCR抑制剂等污染物，最大程度从微量样本中纯化DNA。

　　从血液样本中纯化DNA
　　血液样本可以是新鲜或冻存全血或干血片，由于血液样本在采集后会迅速凝固，所以通常在采血时使用EDTA，柠檬酸盐或肝素进行抗凝。经过抗凝处理的血液样本可以直接用于 DNA纯化，需要注意的是使用的DNA纯化方法需要能够去除上述抗凝剂，以免干扰下游 PCR检测。全血也可以在DNA纯化前先进行白细胞富集等再进行DNA纯化。
　　从血液中纯化DNA的产量很大程度上取决于血液中的白细胞数量，而白细胞数量则和血液的供体情况有很大关联（如贫血或感染都会造成白细胞数量变化）。上述情况必须在进行DNA纯化前就应该考虑到。此外，有些动物有有核血，这意味着这类样本中含有更多的 DNA，在从此类血样中纯化DNA，上样量需要减少10倍左右。

　　从细胞中纯化DNA
　　哺乳动物细胞可以使用蛋白酶K进行裂解。
　　酵母细胞需要首先使用溶菌酶对细胞壁进行处理，然后使用蛋白酶或蛋白酶 K 进行消化。
　　许多细菌细胞可以使用裂解buffer和蛋白酶/蛋白酶K进行裂解，某些细菌如革兰氏阳性菌需要预先使用溶菌酶对细胞壁进行处理。
　　细菌细胞需要先从生物体液中沉淀，然后从中纯化细菌DNA，拭子样本需要先使用杀菌剂进行预处理然后再离心。
　　使用机械裂解会比用酶消化的效果要好，尤其是针对革兰氏阳性菌或真菌而言。

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