HPLC使用中的七个常见错误

[2016/5/11]

由于没有考虑到使用一些可以替代的办法，目前还有七种传统做法仍然存在于HPLC的技术应用中，而这些做法其实非常不利于HPLC技术的效率提高、运行成本的降低以及运行时间的缩短。本文中将提出一些可行的传统做法的替代方法，有些人可能会对这些替代方法出现争议，但如果应用得当的话，这些替代方法势必会产生显著的效果。因为相比不停地机械劳作，分析科学家应该更聪明地工作。

常见错误之一——色谱柱用粒径5µm的颗粒填充

　　回想一下，多年来标准HPLC分析柱(250mm×4.6mm)都是采用5µm 粒径颗粒填装的，然而，事实上3µm 粒径颗粒填装的色谱柱(150mm×4.6mm)具有更好的分离效果及更短的分析时间。同时，现在许多实验室标配的色谱仪是超高压液相色谱(UHPLC)和液相色谱-质谱(LC-MS)，所以色谱柱更应该换成3µm 或sub-2µm 填装的色谱柱。

　　值得注意的是：3µm 粒径颗粒填装的色谱柱进口孔隙更小，更容易被“脏”的样品堵塞。

　　常见错误之二——使用4.6mm内径色谱柱(1mL/min)

　　自20世纪70年代初，HPLC分析柱的“标准”内径就已经是4.6mm了，而近年来，在努力减少溶剂消耗、节约样品的目标下，许多实验室已经开始将3.0mm内径的色谱柱作为更好的选择，来代替使用4.6mm内径色谱柱了。如果使用现代的中间分散HPLC仪的话，柱率和柱外频带展宽的效果通常不会受到任何负面影响。总之，使用较小内径的色谱柱是有利的，在梯度洗脱条件下可以获得更高的分辨率。

　　常见错误之三——对HPLC的流动相进行过滤

　　通常经净化系统所得的HPLC级溶剂和水已经足够干净了，如果我们再给它一次额外的过滤，那只会适得其反，引入不必要的化学污染。事实上，许多实验室都有自己的一套色谱仪器保养维修计划，每年对HPLC系统中的过滤器进行更换，所以我们没有必要再对流动相进一步过滤。

　　例外的是：如果你使用的是离子对试剂、低纯度缓冲剂或高盐含量的流动相时，仍然强烈建议你对流动相进行过滤。

　　还有一种情况是有必要进行额外过滤的，即如果由于水源的质量不好或者其他原因导致从净化系统流出的水不够干净的时候。

　　常见错误之四——使用缓冲剂流动相

　　当分析酸性或者碱性分析物的时候，有必要对流动相进行酸化或者碱化。简单的流动相如含0.1%(体积比)甲酸的水溶液，仅需要将1mL甲酸定容到1升水中即可迅速制备。同样，含0.1%(体积比)氨的水溶液可以用于多种高pH值兼容柱。当使用低硅羟基活性柱时，无论用低还是高pH值流动相运行，缓冲剂其实都很少用到，包括以流动相A为稀释剂配制进样样品溶液时。

　　例外的是：当分析复杂分子、复杂混合物时，可能仍然需要用缓冲剂流动相，以保持高的选择性和特别适中的pH值的流动相。

　　常见错误之五——每次试验都重新配制新的参考标准溶液

　　在药品的质量控制实验室中，往往每个试验都会重新配制新的参考标准溶液，实际上这是没有必要的。许多药物在低温和适当的贮存条件下溶液具有足够的稳定性。所以你可以一次性配制几百个合格的参考标准溶液置于HPLC小瓶中，然后冷藏或冷冻贮存供以后分析用。而对于试验结果的长期稳定性研究来说，更应该采用由同一个原始溶液配制而成的标准溶液。当然，对于通常的试验，标准溶液的储存条件下的稳定性(保质期)是应该经过验证的，并记录首次配制时间。这里值得我们注意的是：所有的操作都需要做好记录。

　　常见错误之六——对样品瓶进行摇动

　　摇动(或反转)样品瓶会在样品瓶盖下面形成一层液体膜，这会对HPLC自动进样器造成干扰以至于给出一个混乱的试验结果。所以即使在排除了故障的情况下，也要始终警惕这一点。

　　例外的是：如果样品是冷冻过的，那么解冻后，需要进行涡旋或摇动以确保样品均匀。

　　常见错误之七——使用不锈钢卡套作为柱的接头

　　HPLC系统通常安装有不锈钢接头和套圈，大多数情况下它们工作得都很好，但是它们不适合用于需要频繁更换色谱柱时的连接。

　　首先，不锈钢卡套只能与为其量身定制的端部管接头相匹配，而对于不同的色谱柱来说这种“量身定制”只会适得其反。

　　其次，预制的不锈钢接头只能够重复密封5-10次。当某些制造商的不锈钢接头用于其他品牌的色谱柱时，由于不同端部接头和插入深度的关系，这个问题会变得尤其明显。

　　一个可能的解决方案是使用可以用手指拧紧的聚醚醚酮(PEEK)管件，它们价格低廉，并且在5000psi(34.47MPa)压力下的密封效果也很好。许多较新的UHPLC接头，其额定压力为20,000psi(137.9MPa)，只需用手指拧紧，然后用扳手再转四分之一圈就可以

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