植物材料RNA的3种提取方法

[2017/3/7]

1. 利用RNeasy Plant Mini Kit提取总RNA

    1) 于1.5 ml离心管中加入0.5 ml RLT缓冲液和5ul β-巯基乙醇;

    2) 称取约100 mg材料,液氮研磨后转移到提取液中,涡旋混匀,56℃,2 min;

    3) 加入紫色柱子,23℃, 12000 rpm,离心2 min;

    4) 滤液转入一新的1.5 ml离心管中,加入1/2体积的无水乙醇,用枪头混匀,移入粉色柱子,23℃, 12000 rpm,离心15 sec;

    5) 弃滤液,加入700 ul RW 1,23℃,12000 rpm,离心15 sec;

    6) 将柱子移入一新的2 ml收集管,加入500 ul RPE,23℃, 12000 rpm,离心15 sec;

    7) 弃滤液,加入500ul RPE,23℃, 12000 rpm,离心2 min;

    8) 加20 ul DEPC处理过的水,室温静置15 min,23℃,12000 rpm,离心1 min;

    9) 再分别加入40 ul和20ul DEPC处理过的水,室温静置15 min,23℃,12000 rpm离心1 min;

    10) 合并三次收集的RNA,取2ul电泳检测纯度和质量。-20℃短时间保存,或-80℃长期保存。

2. 利用TRIZOL试剂盒提取RNA

    1) 于1.5 ml离心管中加入1 ml TRIZOL提取液;

    2) 称取约100 mg液氮研磨后的材料,转移到提取液中,混匀,2-8℃,≤12000 g离心10-15 min;

    3) 取上清,于15-30℃放置5min,加0.2 ml氯仿,剧烈摇动15 sec, 15-30℃放置2-3min,2-80C, ≤12000 g,离心15 min;

    4) 取水相,加等体积异丙醇,15-30℃放置10 min,2-8℃,<12000 g,离心10 min;

    5) 用75%乙醇洗涤沉淀,2-8℃,<7500g离心5 min;用DEPC处理的水溶解RNA,-20℃短时间保存,或-80℃长期保存。

3. CTAB法提取植物总RNA

    1) 50 ml离心管中加入15 ml CTAB提取缓冲液(需加入300ul β-巯基乙醇),65℃预热;

    2) 称2-3 g新鲜的植物材料,在液氮中充分研磨成粉末;

    3) 样品转入50 ml离心管中,迅速震荡混匀至无成团结块,65℃温浴10 min,再加入15 ml氯仿,混匀;

    4) 室温下,10000 rpm,离心15 min,上层水相移入一个新的离心管,加入等体积的氯仿,混匀后再抽提一次;

    5) 将上层水相转入另一离心管中,加入 8M的LiCl,使终浓度为2M(约加入水相的 1/3),4℃,过夜;

    6) 4℃,12000 rpm,离心20 min沉淀RNA弃上清,用70%乙醇洗涤沉淀,晾干;

    7) 加入500ul SSTE溶解沉淀,转移至1.5 ml离心管中,加入等体积酸性酚/氯仿后混匀;

    8) 室温下,13000 rpm,离心10 min,将上层水相转移至另一1.5 ml离心管中,加入等体积的氯仿后混匀;

    9) 室温下,13000 rpm,离心10 min,上层水相转移至新管中,加入1/10体积的3M NaAC和2倍体积无水乙醇,-80℃静置30 min;

    10) 4℃,13000 rpm,离心20 min,70%乙醇洗涤沉淀,烘干后加入50 ul DEPC处理H20溶解RNA,取1ul电泳检测,-80℃保存备用。

4. RNA的纯化

    1) DEPC水处理的1.5 ml离心管中加入:45ul  RNA,7.5ul l0XDnase Assay Buffer,20U RNase inhibitor 1.5ul Dnase I,混合液于37℃温浴30 min;

    2) 用DEPC-H20将溶液体积调至250ul,加1/10体积的3 M NaAC(pH 5.2)和2倍体积冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置30 min;

    3) 4℃,12000 rpm,离心20 min,沉淀RNA;

    4) -20℃预冷的70%乙醇洗一次,-20℃预冷的100%乙醇洗一次;

    5) 干燥后,用20 ul DEPC处理的H2O溶解,-20℃保存。