冷冻电镜揭示g分泌酶复合物三维结构
[2014/7/4]
清华大学生命科学学院施一公研究组在《自然》(Nature)杂志以长文形式(Article)在线发表了题为“Three dimensional structure of human g-secretase”的科研论文，在世界上首次报道了与阿尔兹海默症(老年痴呆症)发病直接相关的人源g-secretase的精细三维结构，为理解 g-secretase的工作机制以及阿尔兹海默症(Alzheimer’s Disease, AD)的发病机理提供了重要线索。
阿尔兹海默症是一类神经退行性疾病，临床表现为脑组织切片中出现淀粉样斑块，神经元逐渐死亡，认知和记忆能力受损，大脑功能逐渐丧失，病人逐渐丧失独立生活能力，最后脑功能严重受损直至死亡。美国前总统里根和英国前首相撒切尔夫人都罹患该疾病。据不完全统计，我国目前大约有500万阿尔兹海默症患者，占世界发病总数的四分之一。由于缺乏特效药物，该疾病不但给病人及家属造成极大痛苦，也同时带来沉重的社会负担。
阿尔兹海默病的发生和大脑中淀粉样斑块的形成密切相关
研究证明：淀粉样斑块是由膜整合蛋白酶复合物g -secretase异常切割淀粉样前体蛋白APP (amyloid precursor protein)而产生过量易聚集的Ab42肽段所致。g -secretase是由四个膜整合蛋白组成的包含19次跨膜螺旋的复合体，包括早老素Presenilin (PS1), Aph-1, Pen-2和Nicastrin四个亚基，其中Presenilin是执行酶活功能的膜整合蛋白酶(intramembrane protease)活性亚基。目前已经在Presenilin上鉴定出一百多个与阿尔兹海默症有关联的氨基酸突变。解析g -secretase的三维结构，并在此基础上理解其正常工作及致病机理，不仅具有重大科学意义，也将对阿尔兹海默症的药物研发起到重要的指导作用。
然而，膜蛋白的结构生物学研究极具挑战性。要进行结构鉴定，最关键的一步是获得纯度高、化学性质均一稳定、有活性的g -secretase复合物。施一公在清华大学建立实验室之后立即针对这个难题启动攻坚。经过大量系统的尝试，以及对表达和纯化方法的不断改造和优化，他们历经数年最终利用瞬时转染技术在哺乳动物细胞中成功过量表达并纯化出纯度好、性质均一、有活性的g -secretase复合体。通过与英国MRC分子生物学实验室合作，对获得的复合物样品进行了冷冻电镜(Cryo-EM)的分析和数据收集，最终获得了分辨率达到4.5埃的g -secretase复合物三维结构。
这项研究成果让人类第一次看到了g-secretase的真实形状、组成、和几乎所有的蛋白质二级结构(a-螺旋和b-折叠)。该结构显示，g -secretase膜内部分呈马蹄型，全部19个跨膜螺旋清晰可辨。在胞外区有一个分子量较大、分辨率相对更高的结构域，即负责底物识别的 Nicastrin亚基的胞外结构域，其原子结构模型得到构建，并初步显示出底物结合的可能位点。
值得一提的是，膜整合蛋白酶主要负责蛋白质受控膜内水解(Regulated Intramembrane Proteolysis, RIP)这一重要生理过程，即跨膜肽链在磷脂双分子层中被膜整合蛋白酶水解剪切的反应。这是二十年前被发现的一个重要的细胞信号转导过程，在从细菌到人类的各种生物体内广泛存在，并参与了生物体发育、胆固醇代谢、胁迫反应等生命活动。膜整合蛋白酶包括三大类蛋白，即丝氨酸蛋白酶Rhomboid, 金属蛋白酶S2P以及天冬氨酸蛋白酶Presenilin和SPP。施一公研究组在过去十年引领着蛋白质受控膜内水解结构生物学研究领域的发展，先后解析了细菌Rhomboid同源蛋白GlpG, 古细菌S2P同源蛋白，以及古细菌Presenilin同源蛋白的晶体结构并揭示了这些膜整合蛋白酶的工作机理。此次获得的g -secretase复合物的三维结构将该领域又向前推进了重要的一步。
注释：
该论文的第一作者卢培龙是生命学院博士研究生。共同第一作者白晓晨博士曾经师从生命学院隋森芳院士，获得清华大学博士学位后在剑桥MRC分子生物学实验室Sjors H.W. Sheres课题组从事博士后研究。共同第一作者马丹也是生命学院博士研究生。此外，清华大学生命学院在读博士研究生谢田、闫创业、孙林峰、杨光辉、赵艳雨和周瑞也对本研究做出重要贡献。
阿尔兹海默症是一类神经退行性疾病，临床表现为脑组织切片中出现淀粉样斑块，神经元逐渐死亡，认知和记忆能力受损，大脑功能逐渐丧失，病人逐渐丧失独立生活能力，最后脑功能严重受损直至死亡。美国前总统里根和英国前首相撒切尔夫人都罹患该疾病。据不完全统计，我国目前大约有500万阿尔兹海默症患者，占世界发病总数的四分之一。由于缺乏特效药物，该疾病不但给病人及家属造成极大痛苦，也同时带来沉重的社会负担。
阿尔兹海默病的发生和大脑中淀粉样斑块的形成密切相关
研究证明：淀粉样斑块是由膜整合蛋白酶复合物g -secretase异常切割淀粉样前体蛋白APP (amyloid precursor protein)而产生过量易聚集的Ab42肽段所致。g -secretase是由四个膜整合蛋白组成的包含19次跨膜螺旋的复合体，包括早老素Presenilin (PS1), Aph-1, Pen-2和Nicastrin四个亚基，其中Presenilin是执行酶活功能的膜整合蛋白酶(intramembrane protease)活性亚基。目前已经在Presenilin上鉴定出一百多个与阿尔兹海默症有关联的氨基酸突变。解析g -secretase的三维结构，并在此基础上理解其正常工作及致病机理，不仅具有重大科学意义，也将对阿尔兹海默症的药物研发起到重要的指导作用。
然而，膜蛋白的结构生物学研究极具挑战性。要进行结构鉴定，最关键的一步是获得纯度高、化学性质均一稳定、有活性的g -secretase复合物。施一公在清华大学建立实验室之后立即针对这个难题启动攻坚。经过大量系统的尝试，以及对表达和纯化方法的不断改造和优化，他们历经数年最终利用瞬时转染技术在哺乳动物细胞中成功过量表达并纯化出纯度好、性质均一、有活性的g -secretase复合体。通过与英国MRC分子生物学实验室合作，对获得的复合物样品进行了冷冻电镜(Cryo-EM)的分析和数据收集，最终获得了分辨率达到4.5埃的g -secretase复合物三维结构。
这项研究成果让人类第一次看到了g-secretase的真实形状、组成、和几乎所有的蛋白质二级结构(a-螺旋和b-折叠)。该结构显示，g -secretase膜内部分呈马蹄型，全部19个跨膜螺旋清晰可辨。在胞外区有一个分子量较大、分辨率相对更高的结构域，即负责底物识别的 Nicastrin亚基的胞外结构域，其原子结构模型得到构建，并初步显示出底物结合的可能位点。
值得一提的是，膜整合蛋白酶主要负责蛋白质受控膜内水解(Regulated Intramembrane Proteolysis, RIP)这一重要生理过程，即跨膜肽链在磷脂双分子层中被膜整合蛋白酶水解剪切的反应。这是二十年前被发现的一个重要的细胞信号转导过程，在从细菌到人类的各种生物体内广泛存在，并参与了生物体发育、胆固醇代谢、胁迫反应等生命活动。膜整合蛋白酶包括三大类蛋白，即丝氨酸蛋白酶Rhomboid, 金属蛋白酶S2P以及天冬氨酸蛋白酶Presenilin和SPP。施一公研究组在过去十年引领着蛋白质受控膜内水解结构生物学研究领域的发展，先后解析了细菌Rhomboid同源蛋白GlpG, 古细菌S2P同源蛋白，以及古细菌Presenilin同源蛋白的晶体结构并揭示了这些膜整合蛋白酶的工作机理。此次获得的g -secretase复合物的三维结构将该领域又向前推进了重要的一步。
注释：
该论文的第一作者卢培龙是生命学院博士研究生。共同第一作者白晓晨博士曾经师从生命学院隋森芳院士，获得清华大学博士学位后在剑桥MRC分子生物学实验室Sjors H.W. Sheres课题组从事博士后研究。共同第一作者马丹也是生命学院博士研究生。此外，清华大学生命学院在读博士研究生谢田、闫创业、孙林峰、杨光辉、赵艳雨和周瑞也对本研究做出重要贡献。
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