干货 | 紫外可见分光光度计的结构、原理与应用
[2020/7/15]
小析姐说过要做一期光谱分析法中分子光谱法的知识分享，所以整理了分子光谱法中常用的几种仪器，今天怎们就先说说紫外可见分光光度计的结构、原理与应用。
紫外可见分光光度计是一类很重要的分析仪器，无论在物理学、化学、生物学、医学、材料学、环境科学等科学研究领域，还是在化工、医药、环境检测、冶金等现代生产与管理部门，紫外可见分光光度计都有广泛而重要的应用。
分光光度计是杜包斯克(Duboscq)和奈斯勒(Nessler)等人在1854年将朗伯-比尔(Lambert-Beer)定律应用于定量分析化学领域，并且设计了第一台比色计。到1918年，美国国家标准局制成了第一台紫外可见分光光度计。此后，紫外可见分光光度计经不断改进，又出现自动记录、自动打印、数字显示、微机控制等各种类型的仪器，使光度法的灵敏度和准确度也不断提高，其应用范围也不断扩大。目前市场上有两类主流产品:扫描光栅式分光光度计和固定光栅式分光光度计。
在分光元器件方面，经历了棱镜、机刻光栅和全息光栅的过程，商品化的全息闪耀光栅已迅速取代一般刻划光栅。在仪器控制方面，随着单片机、微处理器的出现以及软硬件技术的结合，从早期的人工控制进步到了自动控制。在显示、记录与绘图方面，早期采用表头(电位计)指示、绘图仪绘图，后来用数字电压表数字显示，如今更多地采用液晶屏幕或计算机屏幕显示。在检测器方面，早期使用光电池、光电管，后来更普遍地使用光电倍增管甚至光电二极管阵列。阵列型检测器和凹面光栅的联合应用，使仪器的测量速度发生了质的飞跃。
在仪器构型方面，从单光束发展为双光束，现在几乎所有高级分光光度计都是双光束的，有些高精度的仪器采用双单色器，使得仪器在分辨率和杂散光等方面的性能大大提高。随着集成电路技术和光纤技术的发展，联合采用小型凹面全息光栅和阵列探测器以及USB接口等新技术，已经出现了一些携带方便、用途广泛的小型化甚至是掌上型的紫外可见分光光度计。而光电子技术和MEMS技术的发展，使得有可能将分光元件和探测器集成在一块基片上，制作微型分光光度计。随着发光二极管(LED)光源技术及产业的日益成熟，以LED为光源的小型便携又低廉的分光光度计已成为研究开发的热点。除了空间色散的分光方式，也有人对声光调制滤光和傅立叶变换光谱在紫外可见区的应用进行了研究。
仪器的软件功能可以极大地提升仪器的使用性能和价值，现代分光光度计生产厂商都非常重视仪器配套软件的开发。除了仪器控制软件和通用数据分析处理软件外，很多仪器针对不同行业应用开发了专用分析软件，给仪器使用者带来了极大的便利。
一般地，紫外可见分光光度计主要由光源系统、单色器系统、样品室、检测系统组成，如图1所示。光源发出的复合光通过单色器被分解成单色光，当单色光通过样品室时，一部分被样品吸收，其余未被吸收的光到达检测器，被转变为电信号，经电子电路的放大和数据处理后，通过显示系统给出测量结果。
图1 紫外可见分光光度计结构
分光光度计的主要部件如下所述。
光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度，稳定。可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500nm)紫外区：氢灯，氘灯(180～375nm)；氙灯：紫外、可见光区均可用作光源。
单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。
棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同。
光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm)。利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。
吸收池：用于盛待测及参比溶液。可见光区：光学玻璃池；紫外区：石英池。
检测器：利用光电效应，将光能转换成电流讯号。光电池，光电管，光电倍增管。
检流计（指示器）：刻度显示或数字显示、自动扫描记录。
物质的吸收光谱本质上就是物质中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波长的光能量，相应地发生了分子振动能级跃迁和电子能级跃迁的结果。由于各种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相同，因此，每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该物质的含量，这就是分光光度定性和定量分析的基础。
分光光度分析就是根据物质的吸收光谱研究物质的成分、结构和物质间相互作用的有效手段。紫外可见分光光度法的定量分析基础是朗伯-比尔(Lambert-Beer)定律。即物质在一定浓度的吸光度与它的吸收介质的厚度呈正比，其数学表示式如下
A=abc
A—吸光度；a—摩尔吸光系数；b—吸收介质的厚度；c—吸光物质的浓度。
由光源钨灯和氘灯发出的复合光经由步进电机控制带动反光镜M1，反射通过入射狭缝，并进入单色器中，光栅衍射出的单色光经准直镜M2调焦，会聚通过出射狭缝，光束到达斩光器时，一段时间内的光射成为参比光路，另一段时间内的光透射成为样品光路。最后两光交替地照射在检测器(光电倍增管)，如图2所示。
图2 光学系统原理图
光电倍增管检测出的信号经由前置放大器，驱动卡传递给微机控制器，由微机控制器推动驱动卡居中协调各部分，如图3所示。
图3 电气原理图
分光光度法对于分析人员来说，可以说是最常用和有效的工具之一。几乎每一个分析实验室都离不开紫外可见分光光度计。分光光度法具有以下主要特点。
1.灵敏度高
由于新的显色剂的大量合成，并在应用研究方面取得了可喜的进展，使得对元素测定的灵敏度有所推进，特别是有关多元络合物和各种表面活性剂的应用研究，使许多元素的摩尔吸光系数由原来的几万提高到数十万。
2.选择性好
目前已有些元素只要利用控制适当的显色条件就可直接进行光度法测定，如钴、铀、镍、铜、银、铁等元素的测定，已有比较满意的方法了。
3.准确度高
对于一般的分光光度法，其浓度测量的相对误差在1～3%范围内，如采用示差分光光度法进行测量，则误差可减少到0.X%。
4.适用浓度范围广
可从常量(1%～50%)(尤其使用示差法)到痕量(10-8～10-6%)(经预富集后)。
5.分析成本低、操作简便、快速、应用广泛
由于各种各样的无机物和有机物在紫外可见区都有吸收，因此均可借此法加以测定。到目前为止，几乎化学元素周期表上的所有元素(除少数放射性元素和惰性元素之外)均可采用此法。在国际上发表的有关分析的论文总数中，光度法约占28%，我国约占所发表论文总数的33%。
1.检定物质
根据吸收光谱图上的一些特征吸收，特别是最大吸收波长λ max和摩尔吸收系数ε，是检定物质的常用物理参数。
2.与标准物及标准图谱对照
将分析样品和标准样品以相同浓度配制在同一溶剂中，在同一条件下分别测定紫外可见吸收光谱。若两者是同一物质，则两者的光谱图应完全一致。如果没有标样，也可以和现成的标准谱图对照进行比较。这种方法要求仪器准确，精密度高，且测定条件要相同。
3.比较最大吸收波长吸收系数的一致性
由于紫外吸收光谱只含有2～3个较宽的吸收带，而紫外光谱主要是分子内的发色团在紫外区产生的吸收，与分子和其它部分关系不大。具有相同发色团的不同分子结构，在较大分子中不影响发色团的紫外吸收光谱，不同的分子结构有可能有相同的紫外吸收光谱，但它们的吸收系数是有差别的。如果分析样品和标准样品的吸收波长相同，吸收系数也相同，则可认为分析样品与标准样品为同一物质。
4.反应动力学研究
借助于分光光度法可以得出一些化学反应速度常数，并从两个或两个以上温度条件下得到的速度数据，得出反应活化能。
5.纯度检验
紫外吸收光谱能测定化合物中含有微量的具有紫外吸收的杂质。如果化合物的紫外可见光区没有明显的吸收峰，而它的杂质在紫外区内有较强的吸收峰，就可以检测出化合物中的杂质。
6.氢键强度的测定
不同的极性溶剂产生氢键的强度也不同，这可以利用紫外光谱来判断化合物在不同溶剂中氢键强度，以确定选择哪一种溶剂。
7.络合物组成及稳定常数的测定
金属离子常与有机物形成络合物，多数络合物在紫外可见区是有吸收的，我们可以利用分光光度法来研究其组成。
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