显微摄影操作的重要注意事项

[2011/10/13]

　　1.　摄影者对显微摄影装置的调整：包括两目镜瞳孔间距的调整和个人屈光不正的校正。前者指将两目镜的距离按个人的瞳孔间距进行调整，拉动目镜或捻转瞳孔间距调节螺旋。校正屈光时应转动目镜筒上的屈光度调节环，使物镜视野中心的“十”字由单线调成双线，达到完全清晰，并且左右眼应分别调整。每个拍摄者都不宜省略这一步。

　　2.　物镜与摄相目镜不同组合的选择：摄影目镜除放大功能外，并不具备空间分辨功能，只有物镜才具有空间分辨力。在一般条件下，对组织切片厚度在20 μm以下者，应尽量选择较高倍物镜，例如欲放大实物50倍时，选择“20×”物镜配以“2.5×”目镜的组合方式，其清晰度比“10×”物镜及“5×”目镜的组合方式要高些。但是也要考虑切片薄厚和观察标本的特异性的问题，例如在厚度为30 μm以上的冰冻切片上，观察蜿蜒走行的神经纤维或血管时，由于较低倍物镜的焦点深度较长，有利于从不同深度、层次或角度，连续观察分析不在同一平面上走行的神经或血管影像。在这种情况下，还可将物镜与目镜不同组合多次拍摄，最终择其效果最佳者。

　　3.　聚光器的调控使用问题：经验较少的摄影者往往缺少对聚光器高度的调节，也不知光源是否偏离视野中心。不少人只进行了物镜与组织切片间的所谓“上聚焦”，而没有进行聚光器与组织切片间的“下聚焦”，这当然也无法获得最佳清晰度的成像底片。 Kohler 照明法操做步骤如下：①将视场光阑缩至最小，使光阑叶片的通孔呈现其八角形影像;②两手分别捻转载片台下的左右定心螺丝，使光阑影像与视场中心圆圈重合，以校正光路;③调节聚光器高度，使八角形光阑影像由模糊变清晰，即“下聚焦”;④散大该光阑至135帧幅边框(指常规135型负片画幅，24 mm×36 mm)影像外周。再次微调聚光器高度，使光阑象最清晰为止。每变换一次放大倍率时，都要重复进行如上调整步骤。

　　4.　提高摄影反差：组织结构对比反差的好坏，当然取决于组织制备技术的质量。这是提高显微摄影质量的重要环节。但是一般情况下，为了弥补切片中对比反差的不足，常可采用如下的补救措施：①按照物镜上的数值孔径值即NA值，相应地进行聚光器孔径光阑的匹配调节。一般质量优良的物镜镜头上，除标有放大倍率外，同时还标有NA值，NA值越大者空间分辨率相对越高。②如果按此法调节NA值转盘后，若由于组织制备欠佳致使影像反差仍然不足时，则可将物镜孔径光阑的NA值再适当缩小，例如10x物镜可调至0.19等。③如经过上述措施影像反差仍不好，则可将视场光阑从135(指常规135照片画幅24 mm×36 mm)边框外缩至边框内，然后在暗室扩放时，再将视场光阑影像除去。当然，上述的后两种措施，只不过是一种稍作修正的补救办法而已。

　　5.　低倍摄影难度大：低倍摄影有其特殊优点，例如在1(物)×2.5(目)放大倍率下，可拍摄大鼠脑切片一侧全貌，对总览特异性标记物的分布有一目了然之效果，但是低倍物镜分辨力低，焦深较长，利用微调螺旋进行精确聚焦有一定难度。为避免视力的个体差异,应采取欠焦、过焦、正焦3步,聚焦不宜反复进行。

　　6.　油浸镜头的使用：100×的物镜多为油浸镜头，然而，使用后常因镜头擦不净而使镜头受损。替代的办法是滴加超纯水或双蒸水，观察效果与香柏油差别不大。由于100×物镜镜头与切片距离极近，极易碰损镜头，必须先以40×物镜聚焦，再转至100×物镜，轻轻转动聚焦微调螺旋至焦点。为避免镜头损伤，新型100×物镜常有弹簧装置，可使镜头微动伸缩而避免其损伤。

　　7.　其它注意事项: ①按照常规,彩色胶卷应加LBD(色温变换)滤片,黑白胶卷应加IF550(绿色)滤片。LBD滤片可使日光型彩卷获得最佳色温补偿，IF550 滤片则可使黑白卷分光感度与人眼者接近。尽管有人认为不一定需要滤光处理，但因为摄影取决于胶片的化学感光度，并不取决于人们眼睛对视野的直观感受，还是加滤光片为好。②曝光时间的选定，也是一个必需注意的问题。已知在光强与曝光时间两个参数之间，有许多不同的组合，均在曝光的“安全”范围内，但所谓的“安全”范围，并不等于最佳条件，所以作者认为限定曝光时间还是十分必要的，其道理在于胶卷化学感光度有一定限制，一个胶卷36个帧幅若随意变动曝光时间，在36张之间差异将很大，而冲洗胶卷是在同一条件下，难免有些帧幅显影不佳。依据作者的经验，曝光时间一般限定在0.5～1 s，底片的影像效果较佳。③要将重点拍摄的结构置于视场中心，因为自动曝光装置测得的曝光时间，是以视场中心区为标准，而偏离中心区越远越不准。有时为了兼顾结构局解关系，而重点结构又不在视场中心时，则可采取点(spot)曝光法。④若需将一张切片上的结构拍为几张,之后拼接时,可在New Vanox 显微摄影仪器上设有一个锁定键(lock)，有利于解决这一问题，以使同一结构的几个帧幅曝光时间一致，然后在洗照片时将这组照片同时放入显影液与定影液。

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