毕氏酵母电转化法

[2013/9/25]

　　(1)E.coli TOP10F’感受态细胞的制备

　　取10ul TOP10F’菌液，接种于200ml LB液体培养基中活化培养，37℃，200 rpm，16～18小时。取100ul菌液接种于200ml液体LB培养基中。

　　37℃，200 rpm，培养16～18小时。

　　灭菌500 ml离心管，4℃，4000 rpm，20 min。得菌体沉淀。弃上清，菌体用10%甘油重悬并洗涤。重复洗涤3次。

　　第三次离心后，弃绝大部分上清，留下约1ml 液体用于重悬菌体。

　　从制得得感受态细胞中，取200ul于灭菌EP管中，加入连接反应产物5ul，混匀，不要产生气泡，在冰上放置5min。

　　将混匀后得200ul菌液移入电击杯中。

　　使用电击穿孔仪进行转化，设置为电压 2500 V，时间 5 ms。

　　电击后，往电击杯中加入 800ul SOC培养基，冲洗出菌体，转移至灭菌1.5 ml EP管中。37℃，150 rpm ，轻摇45～60 min。

　　取全部均匀涂布于含 Zeocin 25 ug/ml 的LLB-Zeocin平板上，正放，待涂布液不在流动，37℃ 培养12～16小时。

　　(2)线性化质粒DNA对Pichia pastorisGS115的转化

　　取新鲜制备的(或-70℃冻存的)感受态细胞置于冰浴中，使其完全解冻;

　　1)将100μl菌体移出至一新的无菌Eppendorf管中，加入5-20μg线性化质粒(5～10μl)，轻弹混匀，尽数吸出转移到0.2cm型的电穿孔转化杯中;

　　2) 转化杯置于冰浴中5～10分钟，保持低温。

　　3) 电穿孔转化电击条件：电压：1500V;电阻：400Ω;电容：25μF;脉冲时间：10mS;一次电击。

　　4) 电击后，马上在电击转化杯中加入1ml 4℃预冷的1M的山梨醇溶液，用微量移液枪吹打均匀，置于冰浴中;

　　5) 取30℃烘至表面半干的MD培养基平板，在超净工作台上无菌操作涂布平板，400μl/板

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