蛋白质纯化离子交换法

[2015/2/9]

  各种蛋白质分子上可能带有?同的电性,经过离子交换管柱,可依其分子带电性的差异而分离开? (Pharmacia 操作手册, Ion Exchange)。

  仪器设备:

  塑料管柱 (Bio-Rad Econo-Pac column 732-1010, 1.5×12 cm)

  分划收集器 (fraction collector, 另需准备干净试管约60 支)

  浓缩用离心机 (低速5,000 rpm) 及浓缩离心管Centriplus

  药品试剂:

  DEAE Sephacel (胶体体积约15 mL,预先以缓冲液Buffer A-0 平衡好)

  Buffer A-0 (如上述配法)

  Buffer A-300 溶离液:Buffer A-0 加有0.3 M NaCl

  Buffer A-500 溶离液:Buffer A-0 加有0.5 M NaCl

  方法步骤:

  1) 将Econo-Pac 管柱架好,并将三向阀及软管等组合完成。

  2) 震荡DEAE Sephacel 胶体使的悬浮,小心倒入管柱中,让胶体慢慢??,在??过程中随时加入buffer A-0,勿使胶体干掉。

  3) 待胶体??完全后,高?应在15 cm 左右。胶柱以buffer A-0 一直?洗,?速快慢可以?考虑;连接好收集器,每试管收2.5 mL。离子交换法的胶体平衡极为重要,可测?出液的pH 或离子浓?,看是否与buffer A-0 相同,??一样则需要再?洗的。

  4) 样本的添加方法同上述胶体过滤法,并启动分划收集器开始收集,当样本全部没入胶体后,再加入同体积buffer A-0。以buffer A-0 ?洗50 mL 后,去除胶体上方的缓冲液,但勿使胶体干掉。

  5) 然后依序以buffer A-300, buffer A-500 溶离的,每批次?洗各50 mL,注意?换浓?时,胶体上方勿残存上一种溶液。

  6) 收集所有分划,进?蛋白质定?分析以及GUS 活性测定,结果作图。

  7) 收集GUS 活性区,并以Centriprep-30 浓缩至 _______ mL (IEX),记得要保?100 μL。

  8) 离子交换胶体以buffer A-0 洗过50 mL 后,收起?交回。